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本文以对鸡危害最为严重的E.tenella为研究对象,对E.tenella新基因EtCDPK4特性、酶活性及在E.tenella发育过程中所执行的功能进行了研究和分析,为探讨E.tenella入侵宿主细胞的机制和研制高效、安全的抗球虫疫苗和新药物奠定基础。1.柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因的克隆及生物信息学分析利用3’-和5’-RACE技术获得EtCDPK4的全长cDNA序列,该序列大小是2 499 bp,包括5’-端185bp UTR序列,不含有CAAT和TATA序列;3’-端UTR序列,长511 bp,含Ploy(A)尾,没有典型AATAAA序列;ORF长1 803 bp,编码600个氨基酸,预测分子量68.3 kDa;对EtCDPK4编码蛋白的跨膜结构、疏水性、信号肽、理化性质、抗原位点和保守功能模块进行预测。结果显示:该基因编码蛋白没有信号肽和跨膜结构域,可能有16个抗原位点,推测具有良好抗原性。功能结构域分析EtCDPK4可能含2个N-端糖基化位点,3个N-端豆蔻酰化位点,7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,10个蛋白激酶C磷酸化位点和1个酪氨酸激酶磷酸化位点,5个EF-Hand模体Ca2+结合结构域。该基因编码蛋白具有CDPKs家族成员特征性保守结构域。利用qRT-PCR检测EtCDPK4在E.tenella 4个不同发育阶段转录水平差异,结果表明EtCDPK4在E.tenella孢子化卵囊和子孢子阶段均有转录,且子孢子阶段转录水平最高,与孢子化卵囊阶段相比差异极显著。2.柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4重组蛋白表达及其特性的初步研究将EtCDPK4连接到原核表达载体pColdⅠ中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经1 mmol/L IPTG诱导表达可溶性重组蛋白His-EtCDPK4(rEtCDPK4)。利用Ni柱亲和层析纯化rEtCDPK4,纯化的可溶性蛋白免疫新西兰大白兔获得兔抗重组蛋白多克隆抗体IgG,经western-blot分析表明rEtCDPK4具有良好的抗原性。利用IFA技术对EtCDPK4天然蛋白在球虫入侵DF-1细胞后不同发育阶段分布和定位进行分析,结果显示,该蛋白主要位于E.tenella子孢子和第二代裂殖子核前端膜表面;当子孢子入侵DF-1细胞12 h后,蛋白主要位于虫体顶端和带虫空泡膜上,此时表达量极速增加;子孢子入侵DF-1细胞36 h后,表达量下降,主要位于滋养体边缘;虫体刚发育至未成熟裂殖体时,蛋白表达量迅速增加,蛋白均匀分布于整个虫体,当虫体发育为中等阶段未成熟裂殖体时,表达量降低,发育为成熟裂殖体时,表达量又迅速上升,绿色荧光强度变强变亮。E.tenella子孢子入侵DF-1细胞体外抑制实验显示,使用兔抗rEtCDPK4多克隆抗体处理E.tenella子孢子后,与正常兔血清IgG对照组相比子孢子入侵DF-1活力显著减弱,且随着抗体处理子孢子浓度不断增大,入侵细胞能力逐渐降低,当抗体浓度为400μg/mL时,抑制率高达52%。通过免疫印迹检测E.tenella 4个发育阶段EtCDPK4翻译水平结果显示,EtCDPK4蛋白在E.tenella 4个不同发育阶段均有翻译,但在E.tenella第二代裂殖子中翻译水平最高。3.柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4催化活性的初步研究通过构建体外磷酸化反应体系,探究了可溶性rEtCDPK4的酶催化活性特性、不同Ca2+浓度对rEtCDPK4酶活性大小影响以及rEtCDPK4酶活性特异性抑制剂的体外筛选和体内临床验证。结果表明,rEtCDPK4酶活性大小在0.87 nmol·min-1·ml-1左右;rEtCDPK4蛋白激酶活性正常发挥要完全依赖于酶活反应体系中Ca2+,当Ca2+浓度为0时,rEtCDPK4没有任何酶活性,不能够使底物短多肽磷酸化,随着酶活反应缓冲溶液中Ca2+浓度不断升高,可以明显看到rEtCDPK4的酶反应催化活性是不断的增强的;通过体外磷酸化酶活性反应的筛选和E.tenella子孢子体外入侵抑制实验的临床验证,筛选出4种效果较好的EtCDPK4酶催化活性抑制剂,分别是:W-7、H-7、H-89以及Myristoylated Protein Kinase Peptide Inhibitor。这4种抑制剂都能够在一定程度上有效抑制E.tenella子孢子入侵DF-1细胞的能力。4.柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4相互作用底物的筛选为了获得E.tenella子孢子或第二代裂殖子入侵阶段EtCDPK4的相互作用蛋白,构建了EtCDPK4的BD诱饵质粒,利用酵母双杂交技术将BD诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4筛选E.tenella子孢子或第二代裂殖子酵母双杂交cDNA文库获得与EtCDPK4相互作用的底物蛋白。将构建的BD诱饵蛋白进行自激活活性、细胞毒性及诱饵蛋白c-Myc-EtCDPK4是否在宿主酵母菌中表达进行检测。结果表明,构建的酵母BD诱饵蛋白没有自激活活性、细胞毒性且在酵母中能表达,因此可用于酵母双杂交筛选。通过使用BD诱饵蛋白对E.tenella子孢子或第二代裂殖子酵母双杂交cDNA文库的筛选,在SD/-Ade/-Trp/-His/-Leu/X-α-GAL缺陷性固体培养基上共获得88个蓝色酵母单克隆菌落,其中80个成功转化大肠杆菌TOP10进行测序;序列经BLAST分析后,得到10个可能与EtCDPK4相互作用的蛋白,包括未知基因9个,已知基因1个,未命名蛋白6个,4个已报道蛋白,即EtSerpin,Etm094G10,Etm109G06,EtGMP。利用Co-IP的方法验证了EtCDPK4和EtSerpin相互作用关系,结果表明EtCDPK4与EtSerpin存在相互作用关系。