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新城疫(Newcastle Disease,ND)由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)感染引起的禽的高度接触性传染病。该病主要导致禽类呼吸困难、神经紊乱、黏膜出血、排绿色稀便。其感染性强、死亡率高,给全球养禽业造成巨大的经济损失。由于ND的临床症状易与禽流感、传染性支气管炎和传染性喉气管炎等其它家禽呼吸系统疾病混淆,因此,高效简易地能够将ND与其它呼吸系统疾病鉴别诊断的技术研发迫在眉睫。目前,ELISA检测方法已应用于NDV的检测,该方法具有操作简单、快速检测、特异性高等优点,但是由于商品化生产成本高、难以长期保存等缺点限制了其临床上的广泛应用。纳米抗体(Nanobody)是骆驼科体内特有的一种天然缺失轻链和重链第一恒定区的特殊Ig G。纳米抗体可以通过基因工程技术进行修饰而不改变其与抗原的结合特性,易于在不同系统中表达,并能够与多种标签融合表达,从而为疾病诊断提供一种简单、有效的检测方法。近年来,从纳米抗体衍生出的fenobody(铁蛋白融合的纳米抗体)和RANbody(纳米抗体融合报告基因),已用于疫病免疫诊断方法的建立。但是,关于使用fenobody和RANbody作为配对试剂建立夹心ELISA方法的研究仍未见相关报道。因此,本研究首次以fenobody作为捕获抗体,以RANbody作为检测抗体建立NDV病原检测的夹心ELISA方法,为NDV早期检测以及防控奠定基础。本研究的主要结果如下:1. 利用NDV La Sota灭活疫苗作为免疫原免疫成年双峰驼,5次免疫后,血清中抗NDV特异性抗体效价可达1:10~6;通过外周淋巴细胞总RNA的提取、巢式RT-PCR、酶切、连接和电转化TG1细胞,成功构建库容为3.0×10~8的纳米抗体文库;利用噬菌体展示技术,成功筛选出13株抗NDV特异性纳米抗体,其中纳米抗体Nb2,Nb4,Nb24,Nb30和Nb49表现出与NDV较高的亲和力,为后续表达制备fenobodies和RANbodies的靶向纳米抗体。2. 基于铁(Ferritin)蛋白可自组装为笼体蛋白的特性,通过重叠PCR、酶切、连接、转化和原核表达等基本的分子生物学技术,成功构建、表达、纯化了5株纳米抗体(Nb2,Nb4,Nb24,Nb30和Nb49)与铁蛋白的融合蛋白(fenobodies);透射电镜观察5株fenobodies自组装形成24亚基笼体结构,并且间接ELISA鉴定5株fenobodies仍与NDV特异结合;另外,通过比较fenobody与单价的nanobody对NDV的亲和力以及半衰期,发现fenobody对NDV的亲和力是nanobody的12倍以上,半衰期也较nanobody延长2.23倍。3. 通过双酶切、连接、转化成功真核表达了5株纳米抗体与辣根过氧化物酶的融合蛋白(RANbodies)。间接免疫荧光和Western blot鉴定,5株RANbodies(RANbody-NDV-2,-4,-24,-30,-49)成功在HEK293T细胞中分泌表达;ELISA检测发现5株RANbodies仍与NDV特异结合;另外,5株纳米抗体与NDV不同亚单位结构蛋白的结合分析发现,NDV-RANbodies-2,-4,-24,-30,-49均与NDV的F蛋白结合。4. 通过棋盘滴定法,5株fenobodies和RANbodies交叉配对,确定夹心ELISA中NDV-fenobody-4为捕获抗体,NDV-RANbody-49为检测抗体为最佳配对抗体;捕获抗体NDV-fenobody-4的最佳包被量为800 ng/孔,检测抗体NDV-RANbody-49最佳稀释比例为原液1:10稀释。夹心ELISA的最低检测限为血凝效价2~2的病毒悬液和10 ng纯化的NDV颗粒。与两种商品化的NDV检测方法相比,建立的夹心ELISA方法显示出更高的灵敏度和特异性,并可应用于不同禽组织样品中NDV的检测。同时,它与HA检测方法具有98.7%的一致性。综上所述,在本研究中,成功筛选得到13株抗NDV的纳米抗体。然后,首次以衍生自纳米抗体的fenobody和RANbody建立了可以检测不同样品中NDV的夹心ELISA方法,该方法敏感性高,特异性强,操作简单,商品化生产成本低。本研究为NDV新型的快速检测及疫病鉴别诊断方法的建立奠定了基础;此外,建立的该夹心ELISA的平台,可普遍应用于不同抗原夹心ELISA检测方法的建立。