多囊卵巢综合症(polycystic ovary syndrome, PCOS)是引起年轻妇女月经不调、闭经和不孕最常见的原因,在育龄妇女的发病率约4%-8%,占无排卵性不孕病因的50%-70%,严重影响了年轻妇女的生活质量及精神状态。以往从遗传因素、下丘脑-垂体-性腺轴功能失调、卵巢及肾上腺功能异常、胰岛素抵抗、肥胖等方面对PCOS的病因进行了大量的研究,但确切病因及发病机制仍不清楚。近年来,炎症学说倍受关注,已有的临床资料表明PCOS患者亚临床慢性炎症因子水平升高,推测PCOS的发病机制可能与慢性低度炎症性疾病有关。IL-18是近几年发现的一种作用强大的前炎症细胞因子,诱导TNF-α产生,进一步诱导IL-6及CRP的合成。目前研究发现IL-18在炎症级联反应中具有中心地位,对机体的免疫和炎症反应有非常重要的调节作用。最近研究发现IL-18与PCOS有关,特别是PCOS妇女血清中IL-18水平显著升高,其升高的程度与雄激素水平正相关。说明IL-18可能参与了PCOS的发病过程。PCOS以高雄激素血症为特征,卵巢的病理改变是卵泡膜细胞的过度增殖、小卵泡的过度发育及不排卵。卵泡膜细胞控制卵泡的发育及闭锁,调节卵巢甾体激素的合成,是PCOS患者雄激素过多合成和分泌的主要来源,卵泡膜细胞功能的失调节将导致病理状态的发生。研究表明在卵巢卵泡膜细胞表面存在IL-18受体,说明IL-18可直接作用于卵泡膜细胞,并可能参与了卵泡的发育过程。但其对卵泡膜细胞功能的影响及其在PCOS发病过程中可能发挥的作用及机制目前尚不清楚。IL-18刺激效应的信号传导是通过与其受体的结合实现的。IL-18BP是一种能与IL-18高亲和力特异性结合的蛋白因子,它通过与IL-18竞争结合而阻止IL-18与其受体结合,从而有效地抑制IL-18的生物学活性。因此,我们通过体外培养原代卵泡膜细胞,在体外建立无血清原代细胞培养模型来研究IL-18对卵泡膜细胞功能的影响及其可能的作用机制,并进一步探讨了IL-18BP对卵泡膜细胞的保护作用,这不仅可为进一步深入研究PCOS发生的炎症机制提供新的实验依据,也可为PCOS确立新一代治疗方案提供理论基础。本研究分四部分,第一部分采用牛新鲜卵巢进行原代卵泡膜细胞培养及鉴定,为后续实验提供物质基础；第二部分观察不同浓度IL-18,作用不同时间后卵泡膜细胞的增殖情况及类固醇激素合成的改变,观察IL-18在PCOS发病过程中的作用；第三部分通过研究IL-18对卵泡膜细胞中的细胞色素P45017酶、P450胆固醇侧链裂解酶和LH-R表达的影响,及卵泡大小不同其卵泡膜细胞IL-18R表达的不同,探讨IL-18影响卵泡膜细胞功能的可能的作用机制；第四部分探讨IL-18BP-Fc对IL-18诱导的卵泡膜细胞增殖、类固醇激素分泌的影响,观察IL-18BP-Fc是否可抑制IL-18的生物效应,为治疗PCOS提供新的思路。目的：培养出原代卵泡膜细胞,为后续研究提供物质基础。方法：获取新鲜的牛卵巢组织,用酶消化法培养出原代牛卵泡膜细胞,采用Percoll密度梯度离心法进行细胞纯化,运用细胞免疫化学染色方法分别检测细胞的角蛋白、波形蛋白及Ⅷ因子的表达,运用免疫荧光法检测细胞的CYP17A1的表达,从而达到鉴定卵泡膜细胞的目的。结果：镜下观察细胞生长良好,呈单层分布,细胞形态以短梭形为主,台盼蓝染色显示大于90%的卵泡膜细胞存活。细胞免疫化学染色结果显示细胞波形蛋白染色阳性,而角蛋白及Ⅷ因子染色阴性。免疫荧光结果显示细胞CYP17A1阳性表达,说明所培养的细胞为卵泡膜细胞。结论：原代牛卵泡膜细胞培养成功。目的：通过牛卵泡膜细胞原代培养体系,研究IL-18对卵泡膜细胞增殖及甾体激素合成及分泌功能的影响。方法：将相同数量的牛卵泡膜细胞分为对照组和研究组,其中对照组为正常培养细胞组,研究组为给予不同浓度的IL-18(10、30、50、100、300.500.1000 pg／ml)进行干预处理,各组分别于24h、48h及72h后收集细胞上清培养液,采用MTT法检测细胞增殖情况,采用放射免疫法检测细胞雄烯二酮及17羟孕酮的分泌。结果：不同浓度的IL-18干预相同时间后,浓度为10pg/ml-100pg/ml的研究组与对照组比较,细胞增殖的OD值、雄烯二酮与17羟孕酮的浓度的差异均无统计学意义(P>0.05)；浓度为300pg/ml-1000pg/ml的研究组与对照组比较,P<0.01,差异均有显著统计学意义；组间比较,P<0.01,差异有显著统计学意义。同一浓度的IL-18作用于卵泡膜细胞后不同时间(24h、48h、72h),各组OD值及雄烯二酮、17羟孕酮浓度进行比较,浓度100pg/ml以下的实验组,组间比较,P>0.05,差异均无统计学意义；浓度为300pg/ml以上的研究组,组间比较,P<0.01,差异均有显著统计学意义。结论：浓度<100pg/ml的IL-18对卵泡膜细胞的增殖及雄烯二酮、17羟孕酮的分泌无影响；浓度300pg/ml-1000pg/ml的IL-18可以诱导卵泡膜细胞的增殖,促进卵泡膜细胞雄烯二酮及17羟孕酮的分泌,且均呈剂量及时间依赖性。目的：通过牛卵泡膜细胞的原代培养体系,研究大、小卵泡IL-18受体(IL-18R)蛋白及mRNA表达的不同；研究IL-18对卵泡膜细胞中的P450c17酶、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc)和LH-R蛋白表达的影响；研究IL-18对CYP17A1、CYP11A1和LH-R mRNA表达丰度的影响,探讨IL-18诱导PCOS的可能的发病机制,论证IL-18对女性排卵障碍产生影响的可能机理。方法：将相同数量的牛卵泡膜细胞随机分为对照组和研究组,对照组为正常培养细胞组,研究组则给予1000pg/ml的IL-18进行干预,两组均于72h后收集细胞上清培养液,采用Western blot方法检测卵泡膜细胞中P450c17酶、P450scc、LH-R蛋白表达的影响；采用荧光实时RT-PCR方法检测卵泡膜细胞中CYP17A1、CYP11A1、LH-R mRNA表达的影响。根据卵泡直径分为大卵泡组(8-20mm)和小卵泡组(<8mm),分别进行原代卵泡膜细胞培养,采用Western blot方法检测两组卵泡膜细胞中IL-18 R蛋白表达的不同,采用实时荧光RT-PCR检测两组卵泡膜细胞中IL-18R mRNA表达的不同。结果：与对照组相比,研究组卵泡膜细胞的P450c17酶.P450scc及LH-R蛋白表达均增加,差异均有显著统计学意义(P<0.01)。而且研究组卵泡膜细胞的CYP17A1、CYP11A1及LH-R的mRNA表达均显著增加,与对照组相比差异均有显著统计学意义(P<0.01)。小卵泡组的膜细胞IL-18R蛋白及mRNA表达水平与大卵泡组的膜细胞比较,均增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：(1)小卵泡的膜细胞IL-18 R mRNA及蛋白表达均高于大卵泡的膜细胞。(2)IL-18可诱导卵泡膜细胞的雄激素合成过程中的关键酶P450c17酶、P450scc的表达增加,可能是引起卵泡膜细胞雄激素的分泌增高的机制。(3)IL-18可诱导卵泡膜细胞表面LH-R的表达增加。(4)IL-18可能通过与IL-18 R结合发挥作用,而诱导PCOS病理过程的发生。目的：IL-18BP-Fc是一种能与IL-18高亲和力特异性结合的蛋白因子,它通过与IL-18竞争结合而阻止IL-18与其受体结合,从而有效地抑制IL-18的生物学活性。本研究旨在观察IL-18BP-Fc对IL-18诱导卵泡膜细胞增殖及甾体激素分泌的影响,为PCOS的治疗提供新的思路。方法：取相同数量的卵泡膜细胞,随机分为四组：①对照组；②IL-18组；③IL-18BP-Fc组;④IL-18+IL-18BP-Fc组。其中第③组和第④组按IL-18BP-Fc浓度不同分为实验1组(1ng/ml)、实验2组(10ng/ml)、实验3组(100ng/ml)及实验4组(1000ng/ml)。第④组预先用IL-18BP-Fc预处理30分钟后,再加入1000pg/ml的IL-18。各组分别于4h、8h、16h及24h后收集细胞上清液进行检测。MTT法观察细胞增殖情况,放射免疫法检测上清液中雄烯二酮及17羟孕酮的含量。结果：IL-18BP-Fc组与对照组相比,细胞增殖及激素分泌量差异无统计学意义(P>0.05),说明IL-18BP-Fc对卵泡膜细胞无毒性。IL-18BP-Fc浓度为1ng/ml的实验组与IL-18组比较细胞增殖率及激素分泌量无明显差异,P>0.05,并且随着作用时间的延长,无明显变化。IL-18BP-Fc浓度为10ng/ml-1000ng/ml的实验组与IL-18组比较,细胞增殖率及激素分泌量均显著下降,P<0.05,组间比较均有统计学意义(P<0.05)。随着作用时间的延长抑制作用逐渐显著,16h时抑制作用达高峰(r=0.959,P<0.05)。浓度为1000ng/ml的IL-18BP-Fc作用16小时后,可使IL-18诱导卵泡膜细胞增殖及激素分泌的作用降低到约10%的水平,与对照组相比差异无统计学意义。24h时抑制作用明显减弱。结论：一定剂量的1L-18BP-Fc能够抑制IL-18对卵泡膜细胞的刺激效应;IL-18BP-Fc对IL-18的抑制效应呈时间及剂量依赖性；IL-18BP-Fc可能对卵泡膜细胞无毒性,且半衰期长。