第一部分多聚硅裂孔薄膜微结构支架制备背景：肾脏的主要功能是排泄代谢废物,调节水电解质和酸碱平衡,以维持内环境的稳定。为此,它首先需要将血液进行选择性滤过,然后再通过肾小管的重吸收和分泌功能来完成这一功能。目前体外模拟肾脏功能的常用方法是血液透析,其核心部件则是透析膜。临床广泛应用的血液透析膜是一种高分子材料,通过纺丝工艺加工而成,这类膜均存孔径不均一,大小不等,厚度常有数十微米,且很难进一步压缩其体积,也很难进一步添加其他处理元件,如感受器、微型开关等。为此,我们希望能选用一种全新的材料和工艺,以制造一种全新的滤过膜,以便更好的模拟肾小球滤过膜,并希望未来能在此膜上增加其他处理元件,如容量感受器,微型马达、开关等元件。方法：我们选用MEMS工艺,利用硅为主要支架,金属作为多孔隙薄膜这样一个整体框架,该支架结构以硅作为支架基底,在硅支架底面开矩形阵列窗口,在硅支架表面制备金属滤过膜。滤过膜结构中包含滤过膜孔,其结构可以自由选择,而不仅限于圆孔状结构。具体步骤为：1、选择双面抛光并氧化处理的硅片作为基片,通过高能离子束物理轰击,以去除基体表面吸附的颗粒及有机污染物；2、采用Karl Suss公司RC8型甩胶台进行甩胶,控制胶厚度为5微米；3、采用一定的烘温程序对光刻胶进行烘烤；4、采用Ka rl Suss MA6/BA6双面光刻机对光刻胶进行曝光。采用“F”型对准标记,实现掩膜与基片之间的对准,以此确保各层图形的精确对准。曝光光线为波长4000？的紫外光,曝光功率为275瓦,曝光方式为掩膜版与光刻胶表面直接接触的接触式曝光,这样可以得到较高的分辨率,减少图形失真；5、采用固定浸没式显影,以便对经过曝光,溶解性发生变化的、已“潜影”的光刻胶进行选择性溶解。光刻胶经过显影后用去离子水清洗基片并将基片旋转甩干,去除显影后残留在基片表面的所有化学药品。然后通过普通光学显微镜检查显影的效果。如果显影参数控制不当,显影图形可出现缺陷以至影响后续工艺。如有明显显影缺陷,则将基片去胶后重新进行甩胶与光刻工艺；6、光刻胶经过显影、清洗后,在烘箱中进行烘培坚膜处理,随后在空气中自然冷却。7、采用湿法刻蚀工艺以选择性刻蚀二氧化硅,刻蚀液为氢氟酸刻蚀液。8、在另一面分别溅射铬和铜,其中铬是用于键合多金属层的粘结层,而铜为电镀种子层。9、再次通过旋涂光刻胶、曝光、显影等步骤进行图像转移,然后电镀镍以形成滤过膜,10、去除残余的光刻胶；11、分别刻蚀硅和二氧化硅；在对硅进行刻蚀时,选用氢氧化钾碱性溶液作为硅的湿法刻蚀溶液。12、最后电镀金。结果：我们基于标准MEMS工艺对以硅为基础的材料进行图形化、刻蚀、溅射、电镀等一系列加工,在加工期间,对各项加工参数进行了仔细的优化,摸索出一套适合本研究的条件。最终,在我们所设计的硅支架上面形成了一层多孔隙薄膜,该膜厚度约为2-3微米,为了后续研究方便,我们将它切割成1cm×1cm或2cm×2cm大小的方形硅片。最后将所有样品均置于显微镜下,仔细观察孔径形成情况。结果发现：硅支架强度高,表面膜结构完整,其孔隙形态规整,大小一致,完全符合设计要求。结论：MEMS工艺制备的滤过膜孔隙完全规整,其大小、形状分布等均可以根据要求进行自由设计和改变,薄膜的厚度约为2-3微米,同时具有较高的强度。第二部分多聚硅裂孔薄膜的生物相容性和细胞毒性研究前言：所有和体液接触或计划植入体内的材料,必须保证生物相容性良好。而且,为了更好的模拟肾小球功能,我们计划在此多聚硅裂孔薄膜上培养足细胞或内皮细胞。为此,我们首先需要了解该人工滤过膜对细胞的生物相容性,并了解细胞能否在该人工滤过膜上粘附、增生、分化并发挥其功能。材料与方法：前期合成的多聚硅裂孔薄膜经检验合格,用稀盐酸浸泡,以清除前期加工过程中可能残留的各种杂质,然后采用常规消毒灭菌。晾干后分别给予I型胶原、Ⅳ型胶原和Laminin包被,然后通过扫描电镜观察包被液对孔径大小的影响。我们在该薄膜上进行细胞培养,观察包被前后细胞增生情况。并观察培养时死活细胞比例,同时通过MTT试验了解该薄膜对细胞是否存在一定毒性作用。随后我们观察了在该薄膜上培养系膜细胞/MDCK细胞时细胞外基质(纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原)和炎性因子(IL-1 BETA和TNF alpha)的分泌情况。最后,通过扫描电镜观察了MDCK细胞的形态。结果：1、我们在电镜下分别观察了多聚硅裂孔薄膜在细胞外基质包被前后孔径大小。结果发现,不同细胞外基质包被前后膜孔径并没有改变；2、我们的研究表明,当孔径为15μm或以上时,细胞很难在膜上粘附、生长,增殖,当我们缩小膜孔径后发现,在不对多聚硅裂孔薄膜预先进行细胞外基质包被的情况下,细胞仍表现为粘附稀疏,培养困难。而预先予细胞外基质包被后,则细胞容易粘附,增生,并较容易形成单层融合。3、不同包被基质对细胞的粘附和生长作用并不完全相同,其中Ⅳ型胶原包被组在细胞培养初始阶段(1-2天时)就有明显的增生,且与其他组有统计学差异(P<0.05)。但随着培养时间的延长,各组间差异消失。细胞数量在第4天时达到一个顶峰,而进一步延长培养时间,则细胞数量有下降趋势(见图2-3)。4、在多聚硅裂孔薄膜上培养细胞时,在增殖阶段,死细胞数约占总细胞数量的5-13%,这与普通玻璃上培养时非常类似。提示该薄膜对细胞没有明显的毒性作用,并不促进细胞死亡；MTT试验进一步证实了这一点。5、在多孔隙薄膜上培养系膜细胞时,炎症因子IL-1 beta和TN F-ALPHA的释放并不明显,与普通培养条件类似(IL-1 BETA:136.5±20.2 VS 134.2±28.5ng/ml；P>0.05；TNF ALPHA:107.3±21.6 VS 119.0±18.2,P>0.05)；而在给与脂多糖刺激后,人系膜细胞培养上清中IL-6和TN F-ALPHA明显增多(689.0±31.7,658±45.3,和对照组相比,P<0.05)。6、我们在细胞培养上清液中,检测到游离的Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白。多聚硅裂孔薄膜对细胞外基质的合成没有明显的刺激或削弱作用。7、扫描电镜观察结果表明,培养约3-4天后,MDCK细胞就基本形成了扁平融合的单层细胞,细胞形态与常规培养类似。进一步培养后发现,细胞数量并不再增加,但细胞由既往的扁平状变成了立方状,细胞与细胞之间结合紧密,顶端有大量微绒毛形成,提示其功能活跃。结论：我们的研究表明,基于MEMS工艺所制成的多孔隙薄膜对细胞没有明显的毒副作用,不刺激细胞释放炎性因子,不促进细胞的死亡。对该薄膜预先进行细胞外基质包被,将明显促进细胞的粘附,生长,增殖。经过表面修饰后,MDCK细胞和系膜细胞能在该多孔隙薄膜上粘附、生长,增殖、分化,且形态完好,提示其功能正常。第三部分滤过性能测定前言：目前研究表明,肾小球滤过屏障主要由内皮细胞、基底膜和足细胞构成,足细胞在其中发挥着非常重要的作用。因此,我们在多聚硅裂孔薄膜上培养足细胞,并检测了这一复合膜的滤过性能。方法：在多聚硅裂孔薄膜上培养永生化的足细胞,待细胞铺满整个薄膜后,将其放入自制测定小室中,薄膜一侧为含不同分子量的溶质的细胞培养液流过,然后检测流入、流出液中各种溶质的浓度,并检测滤过液的量,以计算其滤过分数和溶质的表观清除率结果：1、在本研究中,我们通过调节气泵将跨膜压设定为10mmHg,通过蠕动泵将细胞培养液的流入速度恒定为2ml/min,结果发现,在一定时间内,滤过液的流速基本恒定为0.52±0.07ml/min。提示该膜的滤过分数约为26%。我们测得维生素B12的表观清除率为1。白蛋白表观清除率约为0.136,人免疫球蛋白IgG表观清除率约为0.019。2、通过调节气泵改变滤过膜的跨膜压力,结果发现,当跨膜压大于40mmHg时,一般均能在滤过液中检查到红细胞,提示在此压力下较容易出现破膜现象,而在20mmhg以下时,多次检测滤过液,均未发现有明显红细胞存在。提示在此压力下,不易出现破膜。3、在液体流量为2ml/min,跨膜压为10mmHg的情况下,循环2小时后,取细胞培养液及滤过液,结果未能在显微镜下发现脱落的足细胞,但如果将时间继续延长,则有时可在细胞培养液中找到脱落的足细胞。结论：多聚硅裂孔薄膜培养足细胞后对细胞培养液的滤过分数为26%。该生物人工复合膜对小分子物质能完全滤过,但对白蛋白和免疫球蛋白等中大分子,亦有一定的滤过,提示我们需要进一步改进其性能。