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目的利用大肠杆菌BL21原核表达系统对spike蛋白的受体结合域(RBD)片段进行融合表达,为进一步研究spike蛋白免疫原性及抗原特性提供了物质基础,同时建立HIS融合表达实验室系统;运用Fmoc技术合成纯化抗原多肽,免疫小鼠获得多克隆抗体,为进一步研究抗体特性并应用于SARS疾病的预防、预后诊断及治疗提供了物质基础。方法1、构建PET32(a)-RBD重组质粒进行原核表达依赖高效T4连接酶连接PET32(a)和RBD,转化感受态BL21大肠杆菌。提取质粒酶切电泳初步确定获得PET32(a)-RBD重组质粒,送TaKaRa公司测序。以IPTG诱导BL21大肠杆菌对融合蛋白进行表达,运用聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-blotting来检测表达产物,保存菌种。2.SARS-CoV的S1蛋白抗原表位多肽合成及其抗体的制备以DNAstar软件对S1蛋白RBD片段的原始序列进行软件分析,选择三段亲水性强,抗原指数高的多肽,运用Fmoc固相法合成三条肽链:CQ19(CFSNVYADSFVVK GDDVRQ)、TY-14(TRNIDATSTGNYNY)和LV-11 (LRPFERDISNV),分别与KLH和BSA偶联成三条具有免疫原性多肽:KLH(BSA)-CQ19 KLH(BSA)-LV11 KLH(BSA)-TY14,免疫BABL/c小鼠剪尾取血检测抗体产生情况(ELISA法)。小鼠在第一次免疫注射之前,首先剪尾取血,该血清作为阴性对照加0.05% NaN3-70℃保存。结果1、PET32(a)-RBD重组质粒构建及其表达:(1)重组质粒构建及鉴定:琼脂糖凝胶电泳及测序表明重组质粒PET32(a)-RBD构建成功。(2)IPTG诱导融合蛋白表达:SDS-PAGE及Western-blotting实验表明融合蛋白在IPTG诱导下大量表达,未经IPTG诱导的细菌对融合蛋白几乎不表达。(见图1.3)。2、合成多肽制备抗体:(1)分析S蛋白:根据DNAstar软件分析筛选S蛋白三段多肽:CQ19(378～396AA)、TY14(425～438AA)、LV11(448～458AA)具有较强抗原性和亲水性。(2)多肽合成:氨基酸组分析表明合成正确序列CQ19、TY14、LV11多肽。(3) KLH-CQ19免疫小鼠获得抗CQ19多克隆抗体:ELISA检测血清结果表明抗体产生为弱阳性。1:10~3和1:10~4滴度OD值约等于阴性对照2倍。(4) KLH-LV11、KLH-TY14免疫小鼠均无抗体产生。结论1、本研究构建了PET32(a)-RBD重组质粒,获得融合蛋白在IPTG诱导下的稳定表达,建立本实验室PET32(a)载体融合的平台,为进一步对SARS-CoVspike蛋白的研究奠定了基础,但其纯化效果及蛋白在纯化后所具有的免疫特性还有待进一步研究。2、应用软件分析技术,合成高纯度抗原多肽片断,免疫动物实验可获得抗CQ19多克隆抗体,为抗spike蛋白抗体的后续研究及临床应用抗体治疗及预防SARS疾病提供了可能。