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第一部分乙醇对内皮细胞凋亡的影响及其作用机制酒精对健康的影响目前尚存在争议,但长期大量饮酒危害健康却不容质疑,可导致高血压[1],动脉粥样硬化[2],心律失常[3],脑血管意外[4]等。研究表明内皮细胞凋亡与许多心血管疾病的发生发展息息相关[5] [6] [7]。以AS为例,在粥样斑块的发展过程中凋亡事件发生率升高,另一方面内皮凋亡的增加也能够引发AS[5]。乙醇的细胞损伤作用,目前大致有直接损伤和氧化损伤两种,就体内所能达到浓度而言,长期大量饮酒造成的细胞损伤作用很大程度上可能与氧化应激[8]有关。探讨乙醇与内皮细胞凋亡的关系、阐明其作用机制,对于深入认识及防治乙醇对心血管系统的损伤具有一定意义。本研究选取人内皮细胞为研究对象,着重观察乙醇对内皮细胞凋亡的影响并探讨其作用机制。(一)乙醇对内皮细胞凋亡的影响目的:观察乙醇对EA.hy926细胞增殖活力及乙醇对内皮细胞凋亡形态学及细胞凋亡率的影响。方法:体外培养EA.hy926,以0.3%,0.6%,1.0%(v/v)乙醇分别孵育细胞至6,9,12 h,采用四甲基偶氮唑蓝(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑,0.5 mg/mL)法检测细胞生长抑制率﹑台盼蓝拒染法检测细胞存活率。0.6%乙醇孵育人内皮细胞EA.hy926至12h,Hoechst 33258荧光染料染色观察细胞发生的凋亡形态学改变。另设阴性对照组,实验组( 0.6%乙醇),联用N-乙酰半胱氨酸组( 0.6%乙醇+ 10 mmol/L NAC),单用NAC组( 10 mmol/L NAC),各组药物均孵育至12h,采用改良Sub-G1法检测细胞凋亡率的变化。结果:乙醇(0.3%,0.6%,1.0%)明显抑制内皮细胞生长。乙醇作用内皮细胞6h,随浓度增高,其对细胞生长的抑制率分别为(29.38±1.69)% ,(35.98±2.23)% ,(40.75±0.55)% ;相应地细胞存活率分别为(78.09±9.81)% ,(73.60±8.34)% ,(69.03±11.56)%。乙醇作用内皮细胞9h,随浓度增高,其对细胞生长的抑制率分别为(12.58±1.44)% ,(18.39±3.26)% ,(28.62±1.13)% ;相应地细胞存活率分别为(85.42±10.97)% ,(77.58±5.01)% ,(71.85±14.06)%。乙醇作用内皮细胞12h,随浓度增高,其对细胞生长的抑制率分别为(7.57±1.17)% ,(10.96±1.28)% ,(13.81±0.83)% ;相应地细胞存活率分别为(94.72±5.65)% ,(89.46±3.67)% ,(84.31±9.77)%。0.6%乙醇孵育EA.hy926后,于荧光显微镜镜下观察,出现大量凋亡细胞,其细胞核呈致密浓染。细胞凋亡率也从对照组的(0.49±0.16)%明显上升至(5.31±0.54)% (P﹤0.01),而联用NAC组细胞凋亡率降低至(1.28±0.24)%,较实验组显著降低(P﹤0.01)。结论:乙醇(0.3%,0.6%,1.0%)抑制人内皮细胞EA.hy926生长,在相同作用时间下,随乙醇浓度的增加该抑制作用增强。0.6%乙醇能够诱导内皮细胞发生凋亡, NAC则能减少乙醇诱导的凋亡。(二)乙醇诱导内皮细胞凋亡的作用机制目的:观察乙醇对EA.hy926细胞SOD活力,MDA含量,细胞活性氧(ROS)水平及细胞游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响。方法:实验分阴性对照组,实验组( 0.6%乙醇),联用NAC组( 0.6%乙醇+ 10 mmol/L NAC),单用NAC组( 10 mmol/L NAC),各组药物均孵育至12h。取细胞超声裂解液,检测细胞SOD活力和MDA含量。另取各组细胞,采用荧光探针DCFH-DA检测细胞ROS及荧光染料Fura-2/AM检测内皮细胞[Ca2+]i。结果:与阴性对照组比,实验组SOD活力由40.8±2.9 U/mg protein显著降低到29.2±4.0 U/mg protein、MDA含量由46.5±3.8 nmol/mg protein升高到89.5±5.6 nmol/mg protein、ROS荧光强度从93.69±7.58升高到162.30±18.85(P﹤0.01);而联用NAC组较实验组,MDA含量显著降低至45.4±3.3 nmol/mg protein、SOD活力增加至37.9±3.0 U/mg protein、ROS荧光强度降低为114.35±9.63(P﹤0.01)。0.6%乙醇处理12小时后,胞内[Ca2+]i为(183.8±19.9) nmol/L,与对照组(149.0±18.0 ) nmol/L相比,明显升高(P﹤0.05);使用抗氧化剂NAC后,胞内[Ca2+]i明显降低至(158.2±8.6) nmol/L。结论: 0.6%乙醇处理EA.hy926后,细胞ROS水平、MDA含量和细胞内[Ca2+]i均显著升高,而SOD活力明显降低。而NAC可以减轻乙醇引起的上述效应。第二部分大鼠体内甲基莲心碱浓度测定的HPLC方法学建立目的:建立大鼠血浆和肝脏匀浆中甲基莲心碱浓度测定的高效液相色谱法。方法:大鼠血浆和肝脏匀浆样品经乙醚萃取,进样分析。采用Hypersil BDS C18 ( 5μm,4.0 mm×250 mm)柱分离,柱温: 25℃。流动相:甲醇︰0.2 M KH2PO4︰0.2 M NaOH︰三乙胺(71︰17︰12︰0.002 v/v/v/v),pH 9.2~9.3,0.45μm减压抽滤,超声脱气5 min,流速0.8 ml/min;进样量:20μL;紫外检测波长:282 nm。结果:血浆中甲基莲心碱的线性范围为0.03125～2.00μg/mL;日内和日间精密度(RSD)分别为小于8.0%和5.0%,绝对回收率为80.4 %～89.2 %。其在肝脏匀浆中的线性范围为0.0625～16.0μg/mL,日内和日间RSD均小于3.0%,绝对回收率为82.5 %～88.4 %。结论:该方法能满足生物样品的检测要求,可应用于大鼠血浆和肝脏匀浆中甲基莲心碱浓度的测定。