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1998年,香港地区报告首起人感染H9N2亚型禽流感病毒(简称H9N2病毒)病例以后,中国大陆也相继出现了人感染H9N2病毒病例。有研究表明,H9N2病毒在我国禽类从业人群中的感染率高达15%左右,并引起急性呼吸道感染症状。当前,H9N2病毒在我国家禽中持续传播,并出现了大规模基因重组,H9N2病毒已经成为人类呼吸道感染的重要病原之一,并作为一个潜在的流感大流行候选病毒而引起了全球的重视。本研究对2011年100份来自浙江省家禽粪便样本进行了病毒分离,对获得的3株H9N2病毒进行全基因序列测定和进化分析；应用生物信息学软件,对网络数据库中H9N2病毒蛋白信息,进行了收集处理,构建一个实用、快速和高效的,能用于H9N2病毒生物学特征分析的蛋白数据分析库；分别在小鼠和人细胞水平上建立了感染模型,通过对Toll样受体(TLR)、NF-κB和IL-6表达水平之间的相互关系进行分析,初步探讨H9N2病毒对人类的致病机制。首先,在2011年2月至6月期间,对来源于浙江省活禽市场中健康家禽的粪便样本进行收集,获得100份样本,并集中进行病毒分离,将获得的3株H9N2和9株H1亚型病毒株进行了基因扩增、序列测定和同源性分析。结果表明,浙江省家禽中存在H9N2、H1N2和H1N3病毒,均为欧亚系；H9N2病毒出现了对金刚烷胺类药物耐药的S31N突变位点。病毒进化分析表明,出现了H9N2和H1N2病毒重组现象,提示需加强家禽中流感病毒监测。本研究在中国范围内首次报道了H1N3亚型流感病毒,为H1亚型流感流行病学研究提供了重要资料。应用生物信息学软件,对网络数据库中所有2013株H9N2病毒的蛋白信息,进行了全面收集和重新处理,建立了一个总共包含PB2、PB1、PB1-F2、PA、HA、 NP、NA、M1、M2、NS1和NS2等11个流感病毒蛋白的数据分析库,共包含了8948条序列信息。分析发现,禽类是H9N2病毒的主要自然宿主(占97.47%),主要分离于1997至2012年期间(占96.32%),主要来自亚洲地区(占96.37%)。有78.10%的H9N2病毒HA蛋白234位氨基酸为亮氨酸,具有与人类细胞优先结合的特性；有9.3%的H9N2病毒M2蛋白出现了对金刚烷胺类药物耐药的S31N突变点。该蛋白数据分析库,能快速进行有针对性的病毒生物特征分析,为有效预测H9N2病毒的感染性、致病性和耐药性提供参考。为了评价H9N2病毒对哺乳动物的致病性,本研究首先在小鼠水平上建立了H9N2病毒诱导急性肺损伤的动物模型,对正常小鼠和受病毒感染小鼠的外周血和肺脏中的IL-6、SOD、TLR4、TLR7和NF-κB表达水平进行检测。结果表明,H9N2病毒浙江株A/chicken/Zhejiang/329/2011(Zj329)能感染小鼠,出现典型的急性临床症状。病毒感染小鼠后,小鼠肺组织细胞中TLR4、TLR7和NF-κB mRNA水平发生了明显上调,并引起外周血中炎性因子IL-6大量表达,在感染后第6d,这些参数值都达到最高。外周血中SOD表达水平在病毒感染后的2-6d内发生下降,在第4d达到最低值。进一步在人肺A549细胞水平上建立了H9N2病毒(Zj329)的细胞感染模型,对Zj329病毒感染后细胞中和细胞上清中TLR4、TLR7、NF-κB和IL-6表达水平进行了检测。结果表明,Zj329病毒能有效感染A549细胞,出现典型的细胞病变现象。病毒感染A549细胞后,细胞中TLR4和TLR7mRNA水平都发生了明显上调,在病毒感染后12h达到最高值,同时NF-κB和IL-6表达活性也发生了明显上调,在24h内随时间增加而增强。综上所述,本研究得出以下结论：1、浙江省家禽中存在H9N2病毒,均为欧亚系。2、首次发现H9N2和H1N2亚型流感病毒之间出现了重组现象。3、H9N2病毒浙江株能有效感染小鼠和人A549细胞,发生肺脏损伤和细胞病变,TLR4、TLR7、NF-κB和IL-6介导了H9N2病毒感染哺乳动物而引起的免疫损伤过程。总之,在近年来禽流感病毒感染人类时有发生的情况下,本研究构建的具有实用和快速的H9N2病毒蛋白数据分析库,为有效分析H9N2病毒的感染性、致病性和耐药性提供参考。通过本研究的开展,获得了H9N2病毒浙江株的相关信息,并在中国范围内首次报道了H1N3亚型流感病毒,发表了相关SCI论文3篇,不仅丰富了我国流感病毒的分子流行病学资料,也将为人感染禽流感防治工作的开展提供科学依据。同时,本研究对于阐明H9N2病毒在感染人类呼吸道过程中的致病机制,具有重要意义。