【摘 要】
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目的:基于脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的RAW264.7细胞炎症模型,探究山楂酸（Maslinic acid,MA）对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响及其对JAK/STATs及p38/JNK MAPK信号通路的调控作用。方法:参考已建立的RAW264.7细胞炎症模型,选用1μg/m L的LPS为后续试验的模型刺激浓度。1.山楂酸剂量筛选:对数生长期的RA
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目的:基于脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的RAW264.7细胞炎症模型,探究山楂酸（Maslinic acid,MA）对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响及其对JAK/STATs及p38/JNK MAPK信号通路的调控作用。方法:参考已建立的RAW264.7细胞炎症模型,选用1μg/m L的LPS为后续试验的模型刺激浓度。1.山楂酸剂量筛选:对数生长期的RAW264.7细胞培养12 h后,将试验分为不同浓度的LPS单独处理组及对照组、LPS组（模型组）及LPS+山楂酸组,Griess Reagent法检测细胞上清中NO含量,MTT法检测细胞活力。2.山楂酸对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响:设对照组、模型组及LPS+山楂酸组,检测细胞LDH活力（微量酶标法）、IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-10的表达（ELISA法）,观察细胞中ROS的释放（DCFH-DA荧光探针法）。3.山楂酸相关抗炎机制研究:将试验分为对照组、模型组及LPS+山楂酸组和山楂酸单独处理组,Western Blot技术检测山楂酸不同作用剂量和不同作用时间下细胞内和细胞核内p-STAT1、p-STAT3-Tyr和p-STAT3-Ser蛋白的表达,并检测了各组细胞内的i NOS、p-JAK2、SOCS3、p-p38、p-JNK和p-ERK蛋白的表达;将试验分为对照组、不同浓度山楂酸单独处理组、地塞米松（Dexmedetomidine,Dex）单独处理组及Dex阳性对照组,Western Blot技术检测山楂酸不同作用剂量和不同作用时间下细胞内Hsp70和HO-1蛋白的表达,检测山楂酸不同作用剂量时Bax和Bcl-2蛋白的表达。结果:1.与对照组相比,LPS在0.5-2.5μg/m L浓度范围内均可引起NO生成量显著增加。不同浓度的山楂酸预作用后,可提高由LPS引起的细胞活力的降低,有效降低由LPS引起的NO生成量的增加。2.与模型组相比,山楂酸显著增加了RAW264.7细胞中IL-10的表达,降低了IL-6、IL-1β、TNF-α的表达、LDH活力以及ROS的释放。3.山楂酸预作用后,与模型组相比,山楂酸显著抑制了细胞内和核内p-STAT1、p-STAT3-Tyr和p-STAT3-Ser蛋白的表达,并呈一定的剂量和时间依赖性;山楂酸也能抑制由LPS诱导的i NOS和p-JAK2蛋白的表达,增加SOCS3蛋白的表达;山楂酸还可降低p-p38和p-JNK蛋白的表达,对p-ERK蛋白的表达无明显影响。山楂酸单独作用RAW264.7细胞后,与对照组相比,随着山楂酸作用浓度和时间的增加,Hsp70和HO-1蛋白表达明显升高;不同浓度的山楂酸作用RAW264.7细胞后,与LPS模型组相比,山楂酸能显著降低Bax蛋白表达和增加Bcl-2蛋白的表达,明显降低了Bax/Bcl-2的比值。结论:1.在LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应模型中,山楂酸通过降低细胞NO的生成、LDH活力、ROS的释放、IL-6、IL-1β和TNF-α的表达,增加IL-10的表达发挥抗炎作用。2.山楂酸呈浓度依赖性和时间依赖性降低LPS诱导的p-STAT1、p-STAT3-Tyr和p-STAT3-Ser蛋白在细胞内及核内的表达,山楂酸可降低LPS诱导的i NOS蛋白的表达和JAK2蛋白的激活,增加SOCS3蛋白的表达,表明山楂酸能通过抑制JAK/STATs信号通路的激活起抗炎作用,还与调控Hsp70和HO-1蛋白的激活相关。3.山楂酸能通过抑制p38/JNK MAPK信号通路发挥抗炎保护作用,且山楂酸能降低Bax/Bcl-2的比值。这些结果为山楂酸天然抗炎药物的开发提供了基础。
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