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研究背景2型糖尿病是一种慢性低度炎症性疾病,以胰岛β细胞功能失调和胰岛素抵抗为主要特征,而胰岛α细胞在血糖维持和糖尿病发生中的作用也不容小觑。T2DM患者体内存在胰岛α细胞功能紊乱,胰腺α细胞与β细胞面积比值增加,胰高糖素与胰岛素比值上调,在糖尿病前期人群中亦存在胰高糖素水平升高。胰岛α细胞分泌胰高糖素的功能,不仅受自身因子调控,更受到环境因素影响,例如邻近胰岛β细胞和5细胞分泌的胰岛素和生长抑素、血液循环中的炎症因子、葡萄糖、脂质和氨基酸等。胰岛β细胞分泌的胰岛素对胰高糖素分泌的抑制作用是维持血糖稳态的重要条件,一旦α细胞中胰岛素信号减弱,则会引起该种抑制作用降低甚至消失,导致胰高糖素分泌亢进,产生“胰岛素抵抗”。高脂饮食是产生胰岛素抵抗的重要因素。高脂喂养的肥胖大鼠血中胰岛素和胰高糖素水平均升高,且升高的胰岛素并不能抑制胰高糖素的分泌,提示α细胞对胰岛素抑制作用的不敏感,即“胰岛素抵抗”。高FFA水平也可通过诱导机体产生氧化应激从而活化NF-κB炎症通路,进而导致外周胰岛素抵抗的发生。在体外,高游离脂肪酸(FFA)(如棕榈酸)刺激可导致α细胞中胰岛素信号通路下调,胰高糖素分泌亢进,其中PTEN发挥重要作用。PTEN作为PI3K/AKT信号通路的负调控因子,其基因敲除小鼠循环中胰高糖素水平降低,精氨酸刺激的胰高糖素分泌减少。高脂饮食后这种低胰高糖素状态仍能持续,并可导致肝脏糖原分解和糖异生相关基因表达减少,从而防止高脂饮食小鼠发生高血糖和胰岛素抵抗。近年来,糖尿病发病率逐年上升,其本身及并发症严重影响患者的生活质量。传统口服降糖药物及胰岛素作用有限,甚至带来不可避免的副反应,因此,以间充质干细胞治疗为中心的再生医学引起广泛关注。间充质干细胞具有自我增殖、多向分化能力,而且能够通过调节局部微环境影响其他细胞功能。MSCs不仅能够保护胰岛β细胞和胰岛微循环内皮细胞免受损伤,而且可以减轻肝脏、脂肪组织等外周组织的炎症和胰岛素抵抗。此外,在诸如心肌细胞、神经细胞等多种细胞中,MSCs还可减少ROS的产生,维持其功能。研究发现,干细胞发挥作用更多是基于其旁分泌功能而非其定向诱导分化能力。在间充质干细胞所分泌的多种因子中,microRNA(miRNA)占据重要位置。miR181是MSCs分泌较多的miRNA之一,其缺乏可增加PTEN活性,抑制PI3K/AKT信号通路的活化,影响机体代谢过程。总之,MSCs可调节多种细胞功能,但目前关于MSCs对胰岛α细胞调控的研究甚少,因此探究其中的发生机制有望为再生治疗提供新的思路和靶点。研究目的本研究旨在探讨MSC-CM在体外对胰岛α细胞的炎症和胰岛素抵抗产生何种影响,以及对α细胞胰岛素抵抗调控的发生机制。研究方法1.BM-MSCs的分离与鉴定:从4周龄Wistar大鼠股骨中提取BM-MSC,将第三代融合至70-80%的MSC进行流式细胞术分析,检测表面标志物CD44、CD90、CD34和CD45的表达情况;经1-2周成脂诱导后,油红O染色观察细胞内脂滴形成;经2-3周成骨诱导后,茜素红染色观察细胞内钙结节形成。2.PA诱导α细胞炎症和胰岛素抵抗:利用0.4mmol/l PA刺激InR1-G9细胞48h,ELISA检测细胞上清中胰高糖素含量,Western blot检测细胞内炎症因子TNF-α、IL-1β以及PTEN和胰岛素信号通路(IR/IRS1/AKT)的表达情况,DCFH-DA荧光探针和流式细胞术检测细胞内ROS含量。3.MSC-CM对α细胞炎症和胰岛素抵抗的影响:PA刺激的同时加入MSC-CM干预,同样利用ELISA检测细胞上清中胰高糖素含量,Western blot检测细胞内炎症因子和信号通路的表达,以及DCFH-DA荧光探针和流式细胞术检测细胞内ROS水平。4.MSCs作用机制探讨:(1)MSCs与α细胞miR-181a比较:分别提取BM-MSCs、InR1-G9细胞以及MSC-CM干预后的InR1-G9细胞中的RNA,通过RT-qPCR方法检测其miR-181a表达情况。(2)miR-181a mimics和inhibitor转染效率验证:利用lipo2000分别将miR-181a mimics和inhibitor及其对应的NC转染至InR1-G9细胞中,利用RT-qPCR方法检测转染效率。(3)miR-181a过表达对α细胞的影响:将miR-181a mimics转染细胞24h后,加入PA继续刺激24h,Western blot检测细胞内PTEN以及胰岛素信号通路的表达水平,ELISA检测上清中胰高糖素含量。(4)miR-181a沉默对α细胞的影响:将miR-181a inhibitor转染细胞24h后,加入MSC-CM继续干预24h,Western blot检测细胞内PTEN以及胰岛素信号通路的表达水平,ELISA检测上清中胰高糖素含量。研究结果1.分离所得的BM-MSCs呈梭形、漩涡状排列,细胞表面CD90和CD44表达呈阳性,CD34和CD45表达呈阴性,符合干细胞的表面标志特点。经过定向诱导后,细胞可分化为含有大量脂滴的脂肪细胞以及含有钙结节的骨细胞。2.PA可导致InR1-G9细胞中ROS产生增多,炎症因子TNF-α、IL-1β以及PTEN的表达上调,胰岛素信号转导受阻,细胞分泌胰高糖素增多。3.MSC-CM可减少细胞内ROS产生,下调炎症因子TNF-α、IL-1β以及PTEN的水平,恢复胰岛素信号通路转导,降低胰高糖素分泌。4.MSCs中miR-181a表达远高于InR1-G9细胞,而且MSC-CM干预可明显增加InR1-G9细胞中miR-181a水平。miR-181a mimics可致细胞中miR-181a过表达,降低PTEN水平,恢复胰岛素信号转导,减少胰高糖素分泌;而miR-181a inhibitor可抑制细胞中miR-181a表达,上调PTEN水平,阻碍胰岛素信号转导,促进胰高糖素分泌。研究结论MSC-CM可减轻PA所诱导的胰岛α细胞的炎症和胰岛素抵抗,MSCs所分泌的miR-181a可通过调节PTEN和胰岛素信号通路参与该过程。