蛋白质泛素化修饰是细胞生命活动必不可少的生化过程,被泛素分子标记的蛋白往往获得不同的命运:改变生化活性或者是被蛋白酶体降解。E2泛素结合酶是蛋白质泛素化修饰过程的关键酶之一,它与E3一起决定底物特异性,给底物添加泛素蛋白,维护泛素链形成的持续性,选择泛素链的连接方式和决定泛素链的长短,因此发挥着重要作用。植物E2蛋白家族成员众多,相关功能报道主要集中在拟南芥中,它们广泛参与植物的光形态建成、生殖和生长发育、花期调控以及各种生物或非生物逆境响应等过程,但是在重要经济作物棉花中鲜有报道。CRISPR/Cas9系统是近年来快速发展的基因组编辑技术,它能够实现基因的定点编辑,因更具高效性和灵活性而广受研究者青睐。目前该技术的主要应用是创造特定基因的突变体,然而棉花中很少有突变体材料用于功能基因的遗传研究,因此在棉花中创建CRISPR/Cas9系统能加快棉花基因功能的研究进展。本研究主要内容分为两部分,分别探讨棉花E2基因GhUBC2L的基因功能以及在棉花中创建CRISPR/Cas9系统,主要结果如下:一、E2基因GhUBC2L参与调控棉花的器官发育1.我们在棉花中克隆到一个注释为E2泛素结合酶的基因GhUBC2L,核酸和蛋白序列比对发现该基因与AtUBC1和AtUBC2高度同源。体外酶活实验验证该基因编码的蛋白具有泛素结合酶活性,亚细胞定位结果显示它在细胞内所有位置表达。2.在棉花中对GhUBC2L分别进行超表达和RNAi干涉,获得的基因干涉植株表现为植株生长变缓,包括叶片、花和成熟种子在内的器官变小,纤维发育也受阻,超表达植株的叶片和花器官明显增大。细胞水平检测发现,GhUBC2L可能通过调控细胞的增殖和膨大来决定器官的大小。3.通过酵母双杂交实验,筛选到与GhUBC2L互作的蛋白Gh Ubox8,体内和体外实验证实两者发生互作。体外酶活实验证实GhUbox8具有E3泛素连接酶活性,同时自身能够-形成二聚体。检测转基因材料间的组蛋白修饰状态,发现干涉植株中H2Bub和H3K4me3修饰水平均显著下降,H2Bub水平下调格外明显,但是还没有建立GhUbox8与组蛋白修饰的联系。4.对关键基因表达量检测,发现JA合成关键基因LOX1,发育相关基因MADS1在干涉中显著下调。最后推测,GhUBC2L可能与包括GhUbox8在内的多个E3连接酶互作,参与不同组蛋白的泛素化修饰,调控关键的发育相关基因的表达,从而调控棉花的正常生长发育。二、棉花中CRISPR/Cas9系统的建立1.我们在棉花中克隆到与拟南芥AtU6-26同源的U6启动子,用于改造能够同时串联多个sgRNA靶标的CRISPR/Cas9表达载体。分别对棉花中异源表达的基因DsRED2和棉花內源基因GhCLA1设计多个sgRNA打靶位点,构建载体并进行棉花遗传转化。2.靶向DsRED2的6个sgRNA位点均能够被编辑,编辑类型以碱基缺失为主。DsRED2基因被敲除的棉花在各个组织中均丢失了红色荧光,红色种子也恢复成野生型状态。遗传分析发现,T0代产生的突变基因型和表型均能够稳定遗传至T1代,而且对没突变的位点能产生持续编辑。3.靶向GhCLA1的4个sgRNA位点均能够被编辑,编辑类型以碱基缺失为主。载体上的两个sgRNA能够同时作用于目的基因,并产生大片段缺失。GhCLA1基因被敲除后产生明显的白化植株,生长发育受到严重的影响,该表型产生效率达到75%。通过分析多个单株的靶标位点基因型和表型发现,产生完全白化的表型需要敲除GhCLA1的所有拷贝。4.为提高突变体单株的检测效率,通过设计Barcode标签标记目的基因的检测引物,结合高通量测序技术,完成对30个单株的突变检测,加快突变检测流程。同时利用高通量测序方法检测26个潜在脱靶位点,没有发现脱靶效应。表明该CRISPR/Cas9系统在棉花中能够高效地和特异地实现基因组编辑,这为后续创建棉花突变体群体打下基础。