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烟曲霉是一种广泛存在于土壤中的丝状真菌,通过降解腐生物质,在碳氮循环中发挥重要的作用。在过去的20多年中,它的致病性引起了人们更多的关注。在医院院内感染的病例中,烟曲霉已超过白色念珠菌成为感染率最高的条件致病真菌。由于缺乏有效的诊断和治疗手段,这类感染的致死率高达30%-90%。因此,对烟曲霉感染机制的研究已成为热点。真菌细胞壁是真菌生长所必需的,细胞壁中的蛋白主要是GPI蛋白。对酿酒酵母和粗糙脉孢菌的研究表明,GPI是细胞存活所必需的,细胞壁GPI蛋白参与细胞壁合成;白色念珠菌的GPI蛋白与其致病性密切相关。酵母中起始GPI合成的酶为GPI-GnT蛋白复合物,由六个亚基构成,其中由GPI3(SPT14)基因编码的蛋白质可能是GPI-GnT复合物中的催化亚单位。但对丝状真菌GPI的合成机制则知之甚少。
通过对烟曲霉基因组的分析找到了一个GPI3/pig-A的同源基因,命名为afpig-α。将afpig-α在毕氏酵母中表达后获得一个55kD的蛋白,但未能测出酶活,说明该蛋白的催化活性需要其它亚基的参与。利用同源重组的方法替换afpig-α基因,获得4个基因突变株。与酵母及其它真菌显著不同的是,△afpig-α突变株并未表现出现温度敏感型和条件致死的表型,突变株可以在30℃-50℃存活,但细胞自溶显著增加。对突变株的生化分析表明,突变株的GPI-GnT酶活丧失,GPI合成被完全阻断,细胞膜上的GPI蛋白消失。证明afpig-α基因编码的蛋白参与烟曲霉GPI的合成。
突变株对hygromycin、Calcofluor white、Nikkomycin Z、Congo red和SDS的敏感性增加,说明其细胞壁和细胞膜发生缺陷。突变株菌丝细胞壁的多糖组份含量发生变化。分析突变株的生活周期发现,孢子萌发加快,菌丝体出现“cell in cell”的异常结构;分生孢子形成时间提前,孢子膨胀易脱落,孢子细胞壁增厚并缺失黑色素层;突变株分泌的蛋白组份也发生变化。这些结果显示,GPI可影响烟曲霉的形态发生。
为了解突变株表型变化的分子机制,本论文还初步探索了突变株中基因表达调控的变化。通过对细胞壁合成、孢子萌发、色素合成等相关基因的表达分析发现,孢子萌发调控基因brlA表达时间提前,细胞壁合成基因gel1/gel2表达量增加,细胞色素合成基因a1b1/abr1/abr2不表达;还发现突变株中MpkA被组成型活化。结果表明,突变株中基因表达的变化可能是由MAPK通路的激活所引起的。
致病性的研究发现,△afpig-α突变株在小鼠免疫缺陷感染模型中的毒力减弱。
研究结果表明,烟曲霉GPI的合成并非其生存所必需的,但却是烟曲霉形态发生和致病性所必需的;烟曲霉GPI合成缺陷所导致的细胞壁缺陷可激活MpkA,MAPK信号通路的激活可能是导致形态发生相关基因表达变化的原因之一。