草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda（J.E.Smith）是原产于美洲热带和亚热带地区的杂食性害虫,是被全球预警的农业重大害虫之一,危害全球超过96个国家或地区。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是一种杆状的革兰氏阳性细菌,其芽胞形成时期能够产生由基因Cry/Cyt编码的杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins,ICPs）,在营养生长期分泌营养期蛋白（vegetative insecticidal proteins,Vips）,均对草地贪夜蛾有毒害作用。种植转基因Bt作物是防治草地贪夜蛾主要防治方式之一,其抗虫性持久、绿色环保、成本低。本实验室前期在四川各地的土壤中分离并克隆了超过40个杀虫新基因,初步生测表明这些基因分别抗鳞翅目、双翅目等害虫。我们从前期研究中筛选出5个抗鳞翅目害虫如甜菜夜蛾、棉铃虫等的Bt基因,用于鉴定其对草地贪夜蛾的毒性,并将该基因转入水稻、玉米等作物,以期为防控草地贪夜蛾危害提供新的基因资源。主要研究结果如下:1.采用密码子优化软件对5个目的基因（Cry2Ag1、Cry56Aa1、Cry53A、Vip3Aa28、Vip3Aa29）的碱基序列进行优化,再通过全基因合成将目的基因克隆到表达载体p ET30a中。利用大肠杆菌BL21（DE3）原核表达系统,成功获得上述5个蛋白,并进行亲和层析纯化。2.将目的蛋白加入饲料中饲喂草地贪夜蛾幼虫,统计幼虫的死亡数并通过软件分析计算,确定5个毒蛋白对草地贪夜蛾的半致死浓度。Cry2Ag1、Vip3Aa28、Vip3Aa29毒蛋白对幼虫的半致死浓度分别为4.380μg/m L、18.5450μg/m L、9.5355μg/m L,对草地贪夜蛾的作用活性不高;Cry56Aa1、Cry53A毒蛋白对幼虫的半致死浓度分别为292 ng/m L、621 ng/m L,对草地贪夜蛾有较高的作用活性。最终筛选出两个作用活性较高的抗草地贪夜蛾Bt基因Cry56Aa1、Cry53A。3.对存活下来的幼虫进行体重、化蛹率、羽化等参数的统计计算,评估Bt蛋白对草地贪夜蛾幼虫的生长影响。结果显示,随着Cry2Ag1蛋白浓度的升高所饲喂幼虫的体重抑制率升高,化蛹率下降;Cry56Aa1和Cry53A蛋白对幼虫的致死率较高,存活下来的幼虫生长发育也受到抑制作用;Vip3Aa28、Vip3Aa29蛋白低浓度对幼虫的存活率、体重等无影响,对后续羽化产卵有一定的影响。此外,我们发现所有蛋白饲喂的幼虫化蛹后羽化率都极低,即使羽化也无法产卵。这些结果表明Cry56Aa1、Cry53A蛋白能够抑制草地贪夜蛾生长发育。4.我们将加入Cry53A、Cry56Aa1毒蛋白的饲料饲喂草地贪夜蛾幼虫,结果发现幼虫肠腔受损严重,大量的细胞坏死,出现中空的现象,中肠各结构都发生严重病变。中肠微绒毛膜结构疏松、断裂脱落;线粒体严重肿胀甚至破裂,内脊模糊不清;内质网断裂形成泡状结构,排列不整齐;细胞核膜结构断裂不完整,核膜界限不清晰,染色体分布不均匀。这些细胞学结果表明,Cry53A、Cry56Aa1蛋白会严重影响草地贪夜蛾幼虫的中肠结构。5.将3个Cry蛋白分别与2个Vip蛋白分别组合后发现Cry2Ag1+Vip3Aa29和Cry56Aa1+Vip3Aa29组合对幼虫的致死率和体重抑制率高于其单独使用;而Cry53A+Vip3Aa28或Cry53A+Vip3Aa29组合,均较Cry53A单独的杀虫效果更好。这一结果说明Vip蛋白单独使用对幼虫的活性较低,与Cry蛋白结合后对草地贪夜蛾的抑制作用增强。双价蛋白可能存在协同增效作用。6.利用农杆菌介导法将分别将双价外源基因Cry53A+Vip3Aa29、Cry56Aa1+Vip3Aa29导入三系恢复系R818。通过室内抗虫性鉴定,发现食用转Cry53A+Vip3Aa29基因水稻的幼虫存活率极低,随机6个转基因水稻株系中有4个株系对幼虫的致死率高于阳性对照转Cry1Ab1基因水稻,存活的幼虫数量较少。调查发现,存活的幼虫体重几乎未受到抑制,但幼虫化蛹率、蛹重、羽化率受到严重影响。食用转Cry56Aa1+Vip3Aa29基因水稻的幼虫幼虫的存活率也极低,其中有2个株系水稻对幼虫的抗性最高,并且对幼虫的体重影响极大,几乎没有幼虫化蛹。这些结果显示Cry53A+Vip3Aa29、Cry56Aa1+Vip3Aa29基因转入水稻后仍具极强的抗虫性。