目的:研究表明,炎症反应在缺血性脑卒中后发挥重要作用,通过抑制过度的炎症反应具有潜在的神经保护作用。脑中炎症反应的最早参与者是小胶质细胞,且其参与组织损伤和修复的整个发生发展过程。然而活化的小胶质细胞与外周血募集到脑的巨噬细胞具有相似的表型和功能,二者在形态上无法区分。本研究从单细胞和单群细胞水平,分别探讨了小胶质细胞和巨噬细胞在脑缺血损伤后的时空变化,在转录组和蛋白组水平比较了两群细胞的表型和功能差异及其具体的分子机制。通过转录组测序分析了缺血损伤不同阶段小胶质细胞的基因表达谱,探讨了其表型和功能差异,并试图通过在缺血损伤早期干预小胶质细胞的活化,降低损伤引起的炎症反应,从而减少过度的炎症反应造成的脑损伤。方法:1.建立小鼠缺血1 h再灌注模型,通过尼氏染色检测缺血损伤1,3,7 d的脑梗死体积;实时定量PCR（RT-q PCR）检测缺血损伤不同时间点缺血侧脑的M1和M2型炎症因子表达水平;通过流式分析缺血损伤不同阶段缺血侧脑的小胶质细胞和巨噬细胞的细胞比例,并通过分选技术,分选不同时间点的小胶质细胞和巨噬细胞;通过单细胞PCR技术,检测不同时间点100个小胶质细胞和巨噬细胞的42个基因的表达水平;通过单细胞PCR技术,检测缺血损伤3 d单个小胶质细胞和巨噬细胞的42个基因的表达水平;采用免疫荧光染色,检测Ym1和i NOS在CCR2和CX3CR1阳性细胞的表达。2.分选缺血损伤3 d损伤侧脑的小胶质细胞和巨噬细胞,分别通过转录组测序检测10万个细胞的基因表达谱,通过定量蛋白组学分析40万个细胞的蛋白谱;火山图显示差异表达的基因和蛋白,通过生物信息学分析,分别分析差异表达基因和差异表达蛋白所涉及的生物过程和分子功能;分析小胶质细胞的sensome（膜蛋白组）、secretome（分泌蛋白组）、和transcriptional regulatome（转录调控组）,探讨小胶质细胞和巨噬细胞在表型、功能和转录调控的分子机制;结合转录组和蛋白组,分析两群细胞差异表达的基因和蛋白,寻找两群细胞潜在的新型标记物;通过流式分析和免疫荧光染色,分别检测CD74,Anxa1,Anxa2和F13a在两群细胞的表达。3.采用免疫荧光染色,检测正常和缺血损伤12 h,3 d的Iba1阳性细胞的形态和分布;分选缺血损伤不同阶段的小胶质细胞,通过转录组测序检测其基因表达谱;通过GSEA分析,探讨所检测到的LG 12 h和3 d小胶质细胞基因所涉及到的信号通路;火山图显示与正常小胶质细胞相比,缺血损伤12 h和3 d小胶质细胞差异表达基因;通过GO分析,分别分析12 h和3 d小胶质细胞的差异表达基因所涉及的生物过程;分析缺血损伤12 h和3 d小胶质细胞的基因表达模式,探讨不同阶段小胶质细胞的表型和功能差异,RT-q PCR检测不同阶段小胶质细胞的差异基因的表达水平;经典通路分析（IPA）分析差异表达基因参与的最主要的经典信号途径;设置体外LPS刺激BV2细胞的炎症模型,通过RT-q PCR和Western blot分别检测Niclosamide抑制对BV2炎症因子和Pcna表达水平的影响;设置体内实验,建立小鼠脑缺血损伤模型,在损伤早期注射Niclosamide抑制Stat3的磷酸化,通过RT-q PCR和Western blot分别检测脑缺血损伤后缺血侧脑的炎症水平和Pcna的表达,进而探讨Stat3信号通路对于脑缺血损伤后的炎症反应的作用。结果:1.在组织水平上,脑缺血损伤早期M1型炎症因子表达水平较高,后期M2型较高,反映了组织从损伤到炎症,再到修复的过程。小胶质细胞和巨噬细胞的基因表达模式不同,前者在缺血损伤早期呈现短暂活化的特点,而后者在缺血损伤后处于持续活化的状态。两类细胞具有不同的表型,其中小胶质细胞是早期M1型炎症因子的主要来源,而后期进入的巨噬细胞是M2型炎症因子的主要来源。M1到M2的转化是两种细胞类型转化的结果,因此M1到M2的转化反映了损伤不同阶段的主要应答细胞的类型。2.结合流式分选、转录组学和蛋白组学,建立了一套系统生物学分析方法,从细胞水平、基因水平和蛋白水平阐述了脑缺血损伤诱导活化的小胶质细胞和浸润到脑的巨噬细胞在表型和功能上存在较大的差异,两群细胞在感受外界刺激,分泌蛋白和转录调控方面均具有特有的一组基因。脑缺血损伤组织水平炎症的高峰期,巨噬细胞在炎症反应相关通路占据主导地位,而该阶段的小胶质细胞最典型的生物过程是细胞周期。此外,寻找到两群细胞特异表达的蛋白,Anxa1和CD74可以作为潜在的标志物,与CD45结合,应用于流式分析过程中区分小胶质细胞和巨噬细胞,而Anxa2则可以用于标记活化的小胶质细胞和巨噬细胞,与静息状态下的小胶质细胞加以区分。3.流式分选和转录组学测序系统分析和比较了脑缺血后12 h和3 d小胶质细胞的基因表达谱。生物信息学分析结果显示缺血后12 h的小胶质细胞的基因表达谱主要与炎症应答相关,而3 d的表达谱则主要与细胞增殖与细胞周期调节有关。IPA分析显示,12 h小胶质细胞高表达的基因参与多条炎症相关通路,包括Stat3通路,急性期反应信号,IL-6信号,TREM1信号,神经炎症信号通路等,其中最显著的是Stat3通路;而3 d小胶质细胞高表达的基因主要参与蛋白合成。干扰Stat3信号通路抑制了LPS刺激活化的小胶质细胞及其炎症因子和Pcna表达,在脑缺血再灌注损伤早期干扰Stat3信号通路,下调了损伤侧脑的炎症因子表达水平。结论:1.流式分选和单细胞PCR,从细胞水平探讨脑缺血损伤后小胶质细胞和巨噬细胞的动态变化;小胶质细胞在缺血损伤早期短暂活化,是早期M1型炎症因子的主要来源;而募集到脑的巨噬细胞呈现持续活化状态,是M2型炎症因子的主要来源;组织水平M1和M2表型的转换,是细胞类型转换的结果。2.结合流式分选、二代测序和定量蛋白质组学建立了一套系统生物学分析方法,从细胞水平、基因水平和蛋白水平阐明了脑缺血损伤诱导活化的小胶质细胞和浸润到脑的巨噬细胞在感受外界刺激,分泌效应蛋白、表面膜蛋白以及转录调控方面的作用;缺血损伤后炎症高峰期,巨噬细胞在炎症反应中发挥主导作用,小胶质细胞更多参与细胞周期等过程;结合转录组和蛋白组数据,寻找到区分小胶质细胞和巨噬细胞的潜在标志物,其中Anxa1和CD74可以用于流式细胞分析;而Anxa2则可应用于免疫荧光染色实验中区分静息和活化的小胶质细胞和巨噬细胞。3.基于转录组测序,系统地分析了脑缺血损伤不同阶段的小胶质细胞的表型和功能变化及其分子机制。找到脑缺血损伤早期小胶质细胞活化的关键信号通路-Stat3通路,并通过损伤早期干预Stat3通路,抑制了脑损伤后的炎症反应,进而减少过度炎症反应引起的组织二次损伤。