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第一部分藤黄酸抑制膀胱癌T24细胞增殖并诱导其凋亡的机制研究目的:研究藤黄酸(gambogic acid, GA)对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响。方法:采用不同浓度的GA作用膀胱癌T24细胞后,在体外通过CCK-8比色法分析细胞的增殖情况;Annexin V-FITC/PI双染和流式细胞仪(FCM)分析细胞的凋亡情况;Hoechst33258荧光染色法观察T24细胞凋亡形态学变化;Transwell侵袭实验检测T24细胞侵袭能力的变化;Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白XIAP、cIAP-1、 cIAP-2、caspase3、caspase8以及caspase9的表达变化。结果:GA抑制膀胱癌T24细胞的增殖和促凋亡,作用呈浓度依赖性,与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。CCK-8法检测结果表明,GA的IC50是2.1μmol/L,并当浓度>1μmol/L时,细胞的增殖能力受到明显抑制。Hoechst33258荧光染色法观察凋亡细胞核呈固缩浓染,或呈碎块状致密浓染,并与GA的浓度梯度呈正相关。FCM法检测结果显示,GA处理后的膀胱癌T24细胞凋亡峰明显(当GA浓度>2.5μmol/L时,凋亡存活率<45%)。Transwell侵袭实验显示随着GA处理>0.25μmol/L(侵袭)或0.5μmol/L (迁移)时,T24和BIU-87细胞的侵袭力和迁移力受到明显抑制(>50%),并与浓度呈负相关。Western blot进一步表明,GA能够竞争性影响T24细胞中XIAP、cIAP1、caspase3、 caspase8、caspase9的表达水平P<0.05),但是对cIAP2的表达没有明显影响(P>0.05)。结论:GA抑制人膀胱癌T24细胞增殖及诱导凋亡,可能与通过下调XIAP和c-IAP1表达、激活caspase-3、caspase-8以及caspase-9而进入凋亡通路的级联反应有关,而与c-IAP2的产生无关。第二部分藤黄酸诱导膀胱癌T24细胞自噬及其相关机制的探究目的:探讨藤黄酸(gambogic acid, GA)诱导膀胱癌T24细胞自噬及其机制。方法:采用不同浓度的GA作用膀胱癌T24细胞后,在体外通过CCK-8匕色法分析细胞的增殖情况;Western blot检测细胞中自噬相关蛋白P53、Bcl-2、Beclin-1的表达变化:激光共聚焦显微镜观察经不同浓度GA诱导的T24细胞促自噬现象。结果:GA>0.5μmol/L时,诱导膀胱癌T24细胞自噬峰明显(自噬率>47%),并且这种促自噬作用与GA呈浓度依赖性,与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。CCK-8法检测结果表明,GA的IC50是2.1μmol/L,并当浓度>1μmol/L时,细胞的增殖能力受到明显抑制。Western blot显示,GA能够下调T24细胞中MDM2、Bcl-2以及升高P53和Beclinl蛋白的表达水平(P<0.05)。结论:GA可抑制人膀胱癌T24细胞增殖及诱导自噬作用,可能与通过下调MDM2和Bcl-2及上调P53的表达,进一步激活Beclin-1而进入自噬通路的级联反应有关。