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天然免疫是机体抵抗病毒感染的第一道防线,在抵抗病毒入侵的过程中发挥着举足轻重的作用。当病毒入侵机体时,细胞通过模式识别受体识别病原体产生的病原相关分子模式,从而激活宿主抗病毒天然免疫。环腺苷-鸟苷合成酶 cGAS(cyclic GMP-AMP synthase)是细胞内最主要的DNA识别受体,能够识别结合细胞质中异常的双链 DNA(dsDNA),催化ATP和GTP产生 cGAMP(cyclic GMP-AMP),cGAMP将信号传递给干扰素刺激蛋白STING(stimulator of interferon gene),STING招募TBK1(TANK-bind kinase 1)和IRF3(Interferon regulated factor 3),促进IRF3的磷酸化和二聚化,然后入核,诱导机体产生干扰素发挥抗病毒作用。Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV-1(Herpes simplex virus type 1)是一种典型的双链DNA病毒,感染后可在人体内长期潜伏,当潜伏感染的病毒被再激活,转变为裂解性感染,造成疱疹的反复发作。近几年的研究发现,cGAS/STING介导的抗病毒天然免疫在宿主抵抗DNA病毒感染过程中发挥着重要的作用。然而,HSV-1进化出多种策略逃逸 cGAS/STING 介导的干扰素信号通路。本文通过筛选能够抑制cGAS/STING介导的干扰素信号通路的病毒蛋白,并探讨其免疫逃逸的具体分子机制,进一步阐述HSV-1逃逸宿主抗病毒应答的作用机制。 第一部分:VP22逃逸cGAS/STING介导的抗病毒天然免疫的研究。我们首先通过双荧光素酶报告基因(DLR)检测方法系统地筛选了抑制 cGAS/STING 介导的 DNA 受体识别信号通路的HSV-1蛋白,发现皮层蛋白VP22可以显著抑制cGAS/STING激活的干扰素启动子活性。通过qRT-PCR实验,发现 VP22可以显著抑制cGAS/STING激活的IFN-β、ISG54和ISG56的mRNA。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建VP22缺失病毒(ΔVP22 HSV-1),发现ΔVP22HSV-1感染比WT HSV-1诱导更高的IFN-β、ISG54和ISG56的mRNA。而且WT HSV-1感染能够显著抑制干扰素刺激DNA(ISD)诱导的IFN-β以及IRF3的磷酸化和二聚化,而ΔVP22 HSV-1的抑制效果明显弱于WT HSV-1。以上结果证实了VP22能够抑制cGAS/STING激活的干扰素信号通路。我们通过DLR实验证实了 VP22作用靶点是cGAS;免疫沉淀实验证实VP22能够和cGAS相互作用,免疫荧光结果显示VP22和cGAS存在共定位;cGAMP活性实验证实VP22抑制cGAS的酶活性。综上所述,我们发现VP22通过抑制cGAS的酶活性,来阻断宿主细胞内干扰素信号的传递,从而逃逸宿主抗病毒天然免疫。 第二部分:UL46逃逸cGAS/STING介导的抗病毒天然免疫的研究。我们首先通过DLR实验,发现UL46能够抑制cGAS/STING激活的干扰素启动子活性,并且确定UL46作用的水平为STING和TBK1。通过qRT-PCR实验,发现UL46可以显著抑制cGAS/STING激活的IFN-β、ISG54和ISG56的 mRNA;病毒感染实验显示与WT HSV-1相比,ΔUL46 HSV-1能够诱导更高的IFN-β、ISG54和ISG56的表达;且对ISD诱导的IFN-β以及IRF3的磷酸化和二聚化的抑制效果明显弱于WT HSV-1。这些结果说明UL46可以负调控cGAS/STING激活的干扰素信号通路。我们进一步通过免疫沉淀,发现UL46能够通过与STING和TBK1的结合,抑制STING的磷酸化,从而阻断干扰素信号通路。 综上,本研究揭示了HSV-1病毒皮层蛋白VP22和UL46分别通过抑制cGAS酶活性和作用于STING和TBK1,来阻断干扰素信号通路的传递,帮助病毒抵抗宿主的抗病毒免疫反应。