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中国是全球糖尿病患病人数最多的国家,目前我国18岁以上人群糖尿病患病率已达到11.2%,形势十分严峻。下肢动脉病变作为最常见的糖尿病慢性并发症之一,其发病率高,病情进展隐匿,不但可导致下肢缺血性溃疡、坏疽乃至截肢,同时能显著增加患者心血管事件和缺血性脑卒中的风险,全因死亡率可增高至3倍。因此,防治糖尿病下肢动脉病变的发生与发展极为重要。研究提示,高血糖、吸烟、脂代谢紊乱、血压升高、高龄、性别等均是下肢动脉疾病的危险因素。同时,随着研究的深入,人们发现2型糖尿病患者出现下肢动脉病变的风险存在很大的个体、种族及地域差异,这揭示了2型糖尿病下肢动脉病变是基因与环境因素共同作用的结果。近些年,针对2型糖尿病及其并发症的相关遗传学研究大多集中于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）上。SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性,这种多态性只涉及到单个碱基的变异。SNP在人类基因组中的发生频率比较高,是人类最常见的遗传变异之一,它能够影响基因的表达,从而与疾病的发生发展相关联。我们知道2型糖尿病本身并非单基因疾病,而是由多种基因异常的总效应形成的具有遗传易感性的疾病,大量研究表明,其并发症同样受到遗传因素的影响,并且由于人种不同及疾病本身特点,单一SNP对于疾病易感性研究的可重复性较低,结合SNP-SNP、SNP-环境因素的交互作用、单倍型等的研究能更好的解释疾病的致病情况。目前针对2型糖尿病下肢动脉病变易感基因的研究仍以单一SNP为主,这种基因-基因、基因-环境因素相互作用是否可能参与其发病机制的研究还不多。因此,本研究的目的是从参与动脉粥样硬化的相关基因多态性位点中筛选出可能导致2型糖尿病人群发生下肢动脉病变的易感位点,从而从遗传学层面分析2型糖尿病下肢动脉病变的致病因素,同时分析易感基因与非遗传因素的交互作用,为疾病的防治提供新的思路。第一部分2型糖尿病患者合并下肢动脉病变的非遗传性危险因素分析目的:探索2型糖尿病患者发生下肢动脉病变的非遗传性危险因素。方法:1.本研究纳入2型糖尿病患者共300例,其中合并下肢动脉病变的2型糖尿病患者150例为病例组（lower extremity arterial disease in type 2diabetes mellitus,T2DM+LEAD组）,不合并下肢动脉病变的2型糖尿病患者150例为对照组（type 2 diabetes mellitus,T2DM组）。2.收集所有患者的基础临床资料及生化指标,统计分析其在LEAD+T2DM组与T2DM组间是否存在统计学差异,采用二元Logistic回归分析校正混杂因素的影响,以筛选出2型糖尿病下肢动脉病变的危险因素。结果:1.在2型糖尿病家族史、BMI、DBP、TC、TG、HDL-C、APOB以及合并高血压、冠心病、脑梗死、颈动脉病变情况等方面,T2DM+LEAD组与T2DM组间比较无显著差异（P＞0.05）。2.年龄、糖尿病病程、男性占比、吸烟及饮酒比例、Hb A1c、WHR、SBP、LDL-C、APOA1在T2DM+LEAD组与T2DM组间有统计学差异（P＜0.05）。3.Logistic回归分析显示:性别、年龄、WHR、Hb A1c、APOA1与2型糖尿病下肢动脉病变的发生相关（P＜0.05）,OR（95%CI）分别为2.286（1.182-4.421）、1.056（1.027-1.085）、1.067（1.031-1.104）、1.153（1.014-1.312）、0.358（0.137-0.940）。结论:性别、年龄、WHR、Hb A1c是2型糖尿病下肢动脉病变的危险因素,APOA1是2型糖尿病下肢动脉病变的保护因素。第二部分动脉粥样硬化相关基因多态性与2型糖尿病下肢动脉病变遗传易感性的关系研究目的:筛选动脉硬化相关基因,探讨其多态性与2型糖尿病下肢动脉病变的相关性。方法:1.本研究纳入2型糖尿病合并下肢动脉病变的患者150例为病例组（T2DM+LEAD组）,2型糖尿病不合并下肢动脉病变的患者150例为对照组（T2DM组）。2.从中国知网及Pub Med网站中检索近10年与2型糖尿病下肢动脉病变、2型糖尿病动脉粥样硬化、2型糖尿病大血管病变相关文章中的多态性位点（SNPs）共75个,涉及56个基因。利用STRING数据库及Cytoscape软件通过基因间相互作用筛选出前20位关键基因共26个SNP位点。采用Mass ARRAY时间飞行质谱技术、Taqman荧光定量PCR及一代测序等方法进行基因分型。3.对基因型分布进行Hardy-Weinberg平衡试验;卡方检验比较两组间SNPs基因型及等位基因频率分布是否存在差异;利用Haploview软件筛选分析单倍型;采用二元Logistic回归分析校正环境混杂因素的影响;用比值比（OR值）及其95%可信区间（95%CI）表示相对风险度。最终筛选出与2型糖尿病下肢动脉病变相关的SNP位点。结果:1.通过筛选条件,最终共有24个SNP位点纳入分析。2.两组间在基因型或等位基因频率分布上,共有3个位点存在差异:APOE基因rs7412位点的基因型和等位基因频率分布在两组间均具有统计学差异,P值分别为0.015、0.013;IGF1基因rs35767位点的基因型分布在两组间存在明显差异（P=0.022）,而二组间等位基因频率分布无差别（P＞0.05）;VEGFA基因rs699947位点在基因型分布上,两组间具统计学差异（P=0.036）,而在等位基因频率分布上无显著差异（P＞0.05）。3.IGF1基因rs35767位点:共显性模型下携带GA基因型的T2DM患者下肢动脉病变患病风险是GG基因型携带者的0.434倍（95%CI:0.228-0.823,P=0.011）;显性模型下AA+GA基因型携带者患病风险是GG基因型携带者的0.489倍（95%CI:0.288-0.829,P=0.008）;超显性模型下GA基因型携带者患病风险是GG+AA基因型携带者的0.430倍（95%CI:0.260-0.730,P=0.002）;其他遗传模式及该位点等位基因频率分布未显示出与疾病的相关性（P＞0.05）。VEGFA基因rs699947位点:共显性模型下AA基因型与CA基因型携带者患病风险是CC基因型携带者的0.420、3.069倍,OR（95%CI）值分别为0.420（0.180-0.979）、3.069（1.189-7.919）;隐形模型下AA基因型携带者患病风险是CC+CA基因型携带者的0.159倍（95%CI:0.030-0.850,P=0.031）;其他遗传模式及该位点等位基因未显示出与疾病的相关性（P＞0.05）。MCP-1基因rs1024611位点:共显性模型下AA基因型携带者患病风险是GG基因型携带者的1.512倍（P＜0.05）,OR（95%CI）值为1.512（1.004-2.279）;隐形模型下AA基因型携带者患病风险是GG+GA基因型携带者的2.382倍（95%CI:1.103-5.141）;其他遗传模式及该位点等位基因同样未显示出与疾病的相关性（P＞0.05）。RETN基因rs1862513位点:显性模型下GG+CG基因型携带者患病风险是CC基因型携带者的0.569倍（95%CI:0.329-0.984,P=0.044）;其他遗传模式及该位点等位基因未显示出与疾病的相关性（P＞0.05）。APOE基因rs7412位点:显性模型下TT+TC基因型携带者患病风险是CC基因型携带者的0.384倍（95%CI:0.167-0.884,P=0.024）;超显性模型下TC基因型携带者患病风险是CC+TT基因型携带者的0.390倍（95%CI:0.170-0.890,P=0.022）;T等位基因携带者患病风险是C等位基因携带者的0.384倍（95%CI:0.173-0.856,P=0.019）;其他遗传模式下未显示出位点与患病相关（P＞0.05）。4.共有三组SNPs间存在连锁不平衡:1号染色体（Chr1）IL10基因上rs1800872、rs1800871、rs1800896三个位点,6号染色体（Chr6）VEGFA基因上rs699947、rs2010963位点,19号染色体（Chr19）TGFB1基因上rs1800470、rs1800469位点。但它们形成的单倍型分布频率在两组间无统计学差异,Logistic回归分析均未显示出各单倍型对2型糖尿病下肢动脉病变存在致病风险（P均＞0.05）。结论:1.IGF1基因rs35767位点GA基因型、RETN基因rs1862513位点GG+CG基因型、APOE基因rs7412位点TC基因型及T等位基因是2型糖尿病下肢动脉病变的保护因素;VEGFA基因rs699947位点AA基因型为2型糖尿病下肢动脉病变的保护因素,CA基因型可增加患病风险;MCP-1基因rs1024611位点AA基因型是疾病的危险因素。2.IL10基因上rs1800872、rs1800871、rs1800896三个位点形成的单倍型、VEGFA基因上rs699947、rs2010963两位点形成的单倍型、TGFB1基因上rs1800470、rs1800469两位点形成单倍型均未对2型糖尿病下肢动脉病变患病风险产生影响。第三部分动脉粥样硬化相关基因多态性与非遗传因素交互作用对2型糖尿病下肢动脉病变的影响目的:研究动脉粥样硬化相关基因-基因、基因-非遗传因素交互作用是否对2型糖尿病下肢动脉病变的患病风险产生影响。方法:1.本研究纳入2型糖尿病合并下肢动脉病变的患者150例为病例组（T2DM+LEAD组）,2型糖尿病不合并下肢动脉病变的患者150例为对照组（T2DM组）。2.从中国知网及Pub Med网站中检索动脉粥样硬化相关基因多态性位点。利用STRING数据库及Cytoscape软件筛选关键基因。采用Mass ARRAY时间飞行质谱技术、Taqman荧光定量PCR及一代测序等方法进行基因分型。3.对基因型分布进行Hardy-Weinberg平衡试验分析;应用广义多因子降维软件（GMDR）构建基因-基因、基因-非遗传因素的交互作用模型;采用Logistic回归模型评估相乘交互作用,采用叉生分析来评价两因素的相加交互作用。结果:1.筛选得到的24个SNPs基因-基因交互作用的GMDR分析提示:由rs35767、rs688、rs1800470组成的三因子最佳交互模型与2型糖尿病下肢动脉病变的发生无关（测试集精确度为0.5407,交叉验证一致性为6/10,但P值=0.1719＞0.05）,其他SNPs组合模型同样无统计学意义（P＞0.05）。2.SNPs与非遗传因素交互作用的GMDR分析提示:年龄与SNPs最佳交互模型（年龄,rs7412）对2型糖尿病下肢动脉病变的发生无影响（测试集精确度为0.5607,交叉验证一致性仅为4/10,但P值=0.3770＞0.05）;性别与SNPs最佳交互模型（性别,rs1024611）可影响2型糖尿病下肢动脉病变的发病（测试集精确度分别为0.6267,交叉验证一致性分别为10/10,P值=0.0010）,其中高危人群患病风险是低危人群的3.1105倍（OR=3.1105,95%CI:1.5912-6.0805）,性别与SNPs三阶交互模型（性别,rs699947,rs3918242）同样显示出统计学意义（测试集精确度分别为0.6210,交叉验证一致性分别为6/10,P值=0.0010）,其高危人群患病风险是低危人群的4.7939倍（OR=4.7939,95%CI:2.3660-9.7131）;病程与SNPs最佳交互模型（病程,rs1799750,rs1800871,rs688,rs1800470,rs7799039）与2型糖尿病下肢动脉病变的发病没有相关性（测试集精确度为0.5771,交叉验证一致性仅为2/10,P值=0.0107＜0.05）;吸烟史与SNPs最佳交互模型（吸烟史,rs429358）对2型糖尿病下肢动脉病变的发生无作用（测试集精确度为0.5057,交叉验证一致性仅为3/10,P值=0.1719＞0.05）;BMI与SNPs最佳交互模型（BMI,rs35767）与2型糖尿病下肢动脉病变的发病无关（测试集精确度为0.5279,交叉验证一致性仅为5/10,P值=0.3770＞0.05）;Hb A1c与SNPs最佳交互模型（Hb A1c,rs7799039）可能会对2型糖尿病下肢动脉病变的发病产生影响（测试集精确度为0.6323,交叉验证一致性为10/10,P值=0.0010＜0.05）,其高危人群患病风险是低危人群的3.3220倍（OR=3.3220,95%CI 1.6413-6.7237）;其余非遗传因素如饮酒史、血脂异常、合并高血压及其他大血管病变、WHR等,在GMDR运行下均未发现其与SNPs的交互模型。3.性别与rs1024611关联分析提示:在校正年龄、吸烟史、Hb A1c、WHR等因素影响后,与女性-GG型（rs1024611野生纯合型）比较,男性-GG型、男性-（GA+AA）型均与疾病发生相关（P均＜0.05）,OR（95%CI）值分别为4.839（1.911-12.254）、3.332（1.431-7.759）,但相加模型结果显示二者无基于相加模型的交互作用（RERI、AP、S的可信区间未同时满足非0、非0、非1的条件要求）;应用二元Logistic回归分析Enter法将性别、rs1024611及二者交互项（rs1024611×性别）引入方程,同时校正年龄、吸烟史、Hb A1c、WHR等协变量影响,结果显示rs1024611与性别无相乘交互作用（P=0.129）。Hb A1c与rs7799039的关联分析提示:在校正性别、年龄、吸烟史、WHR等因素影响后,与Hb A1c＜9%-AA型（rs7799039野生纯合型）相比,Hb A1c＜9%-（AG+GG）型、Hb A1c≥9%-AA型、Hb A1c≥9%-（AG+GG）型均与疾病发生相关（P均＜0.05）,OR（95%CI）值分别为2.673（1.242-5.751）、3.743（1.793-7.813）、2.741（1.282-5.860）;但相加模型结果显示提示二者无基于相加模型的交互作用（RERI、AP、S的可信区间未同时满足非0、非0、非1的条件要求）;应用二元Logistic回归分析Enter法将Hb A1c、rs7799039及二者交互项（rs7799039×Hb A1c）引入方程,同时校正性别、年龄、吸烟史、WHR等协变量影响,结果显示两因素主效应即rs7799039位点AG+GG基因型、Hb A1c≥9%均为2性糖尿病下肢动脉病变的危险因素,OR（95%CI）值分别为2.785（1.304-5.946）、3.668（1.768-7.610）;两因素交互项亦表现出与疾病相关（OR=0.244,95%CI:0.080-0.746,P=0.013）,OR＜1,提示rs7799039与Hb A1c存在拮抗作用。rs699947、rs3918242与性别的关联分析提示:与女性-CC-CC型（rs699947与rs3918242均为野生纯合型）比较,男性-CC-CC型组合、男性-（CA+AA）-（CT+TT）型组合均单独对疾病发生有统计学意义（P均＜0.05）,校正年龄、吸烟史、Hb A1c、WHR等因素影响后的OR（95%CI）值分别为3.864（1.518-9.833）、5.525（1.283-23.800）;应用二元Logistic回归分析Enter法将性别、rs699947、rs3918242及三者交互项（rs699947×rs3918343×性别）引入方程,同时校正年龄、吸烟史、Hb A1c、WHR等协变量影响,结果显示rs3918242（CT+TT型）、性别（男性）均有统计学意义（P＜0.05）,rs699947基因型未显示出统计学意义（P＞0.05）。模型拟合中提示三者存在交互作用（OR=5.359,95%CI:1.172-24.498,P=0.030）。结论:1.候选SNPs基因-基因交互作用可能没有在2型糖尿病下肢动脉病变的发病中发挥作用。2.性别与rs1024611交互作用能够增加2型糖尿病下肢动脉病变的患病风险,但二者既无基于相加模型的交互作用,亦无相乘交互作用。3.Hb A1c与rs7799039交互作用能够增加2型糖尿病下肢动脉病变的患病风险,但二者无基于相加模型的交互作用,存在相乘交互作用,二者相乘交互作用表现为拮抗作用。4.性别与rs699947、rs3918242交互作用能够增加2型糖尿病下肢动脉病变的患病风险,模型拟合中提示三者存在交互作用。5.年龄、病程、吸烟史、BMI与SNPs交互作用可能与2型糖尿病下肢动脉病变的发病无关,在GMDR运行下未发现饮酒史、血脂异常、合并高血压及其他大血管病变、WHR等与SNPs存在交互作用。