氟磷灰石—聚己内酯复合支架的制备及诱导人牙周膜干细胞骨向分化的研究

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[目的]研究不同合成时间氟磷灰石-聚己内酯(Fluoroapatite-Polycaprolactone,FA-PCL)复合支架与材料生物学特性的关系,研发亲水能力强,生物相容性好,具有优秀骨化诱导潜能的FA-PCL复合支架。[方法]制备PCL静电纺丝纳米纤维膜,并在近生理条件下采用水热法在PCL纳米纤维膜表面合成FA涂层,根据合成时间的不同,制备具有不同表面形貌的FA-PCL复合支架材料。通过扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)、能量弥散 X 线光谱分析(Energy dispersive spectroscopy,EDS)、X 射线衍射技术(X-Ray Diffraction,XRD)、水接触角分析(Water contact angle analysis,WCA)等方法对各组材料的理化性能进行检测。同时采用组织块法提取人牙周膜干细胞(Human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs),对第 2 代细胞进行抗体标记,采用流式细胞检测技术进行分析鉴定。选择第3-5代细胞,将细胞接种于各组材料表面(直接法)或与材料浸出液共培养(间接法),采用CCK-8(Cell counting kit)法检测hPDLSCs在各组材料表面的增殖情况。hPDLSCs在材料表面生长28天的过程中,分别在第7天、第21天、第28天采用碱性磷酸酶染色(Alkaline phosphatase,ALP)、茜素红染色(Alizarin red staining,ARS)和细胞冯库萨(Von Kossa)染色观察各组复合支架对hPDLSCs成骨分化的影响。[结果]PCL静电纺丝膜呈三维网状结构,纤维光滑均一,孔隙丰富,FA晶体随着合成时间的变化,以不同的形态及数量结晶于PCL纳米纤维表面,构成不同的表面形貌。PCL-FA-6h组中FA晶体呈梭形,均匀覆盖于纤维表面,此时仍有部分纤维外露;PCL-FA-12h组中梭形晶体几乎完全覆盖PCL纤维;PCL-FA-18h组中晶体生长为体积较大的棒状,部分纤维重新暴露;PCL-FA-24h组中体积较大的棒状晶体完全覆盖于纤维表面。复合材料理化性能表征的结果证明,在不同的合成时间,PCL纳米纤维膜表面均有FA晶体生成,但是结晶程度不同,PCL-FA-24h组的FA结晶程度最高,且亲水性能最好。原代培养第7天,可见细胞爬出、贴壁生长,待细胞生长交汇至80%左右时消化传代,采用第2代细胞进行流式细胞鉴定,CD31、34呈阴性表达,CD90、STRO-1呈阳性表达,证明为间充质来源干细胞。CCK-8结果证明hPDLSCs在各组复合支架上增殖情况良好。ALP、ARS和Von Kossa染色结果提示各组复合支架均可诱导hPDLSCs骨向分化,FA-PCL复合支架各组分化情况均优于PCL纳米纤维膜组;在各组FA-PCL复合支架中,随合成时间延长,总体趋势hPDLSCs骨向分化程度提高,提示复合支架骨化诱导潜能提高。[结论]通过控制合成时间,可以改变FA-PCL复合支架的表面形貌,进而改变支架的理化性能。PCL-FA-24h组亲水性能最好,晶体成熟度高。不同合成时间的各组FA-PCL复合支架均具有良好的生物相容性,在诱导hPDLSCs骨向分化方面优于PCL纳米纤维膜,提示FA涂层可提升材料的骨化诱导潜能。PCL-FA-24h组复合支架可优选用于骨组织工程支架研究。
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