【摘 要】
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该文旨在研究与HBV的核心启动子的结合肝细胞特异性蛋白质因子,以进一步了解HBV的致病机理.该研究应用噬菌体表面展示技术,以HBV核心启动子(HBV core promoter)的聚合酶联反
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该文旨在研究与HBV的核心启动子的结合肝细胞特异性蛋白质因子,以进一步了解HBV的致病机理.该研究应用噬菌体表面展示技术,以HBV核心启动子(HBV core promoter)的聚合酶联反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"过程,经噬斑的PCR扩增后,构建T-A克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索.噬菌体经富集后,从随机筛选的20个克隆中得到6个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了和HBV核心启动子结合的肝细胞蛋白-羧肽酶N(CPN).CPN是分子量280KD的四聚体,包含两个50KD酶性亚单位和两个83KD调节亚单位.CPN是一种从多肽和蛋白质C端氨基酸残基分离的血浆金属蛋白酶,它在调节激肽和过敏毒素的生物活性上起关键作用.HBV核心启动子和羧肽酶N(CPN)的PCR产物经1％琼脂糖电泳鉴定与预期大小符合,分别为206bp和580bp.重组载体经双酶切鉴定后,证明HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N(CPN)的真核表达载体构建成功.脂质体法瞬时转染NIH3T3细胞48小时后,用ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达,显示核心启动子在羧肽酶N(CPN)的影响下,其活性有大约5-6倍的增加.通过体内实验证明羧肽酶N(CPN)可以上调HBV核启动子的表达.结果提示:⑴确定了和HBV核心启动子结合的肝细胞蛋白-羧肽酶N(CPN).⑵通过体内实验证明羧肽酶N(CPN)可以上调HBV核心启动子的表达.⑶在该实验中,首次成功的运用DNA为固相靶分子筛选人肝cDNA文库.我们认为,该技术作为一种研究DNA-蛋白相互作用的方法,可进一步用于相关研究.
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