结直肠癌(Colorectal carcinoma,CRC)的发病率和死亡率多年以来一直居高不下,从全世界来看CRC的发病率居于第三位,而死亡率高达第四位,而我国CRC的发病率和死亡率同样高居前几名。CRC的高发病率与高度城市化相关,近几十年来,伴随着经济的快速发展,人们的生活习惯发生了根本性的变化,譬如饮食、久坐以及熬夜等,加之食品和环境污染,我国部分地区CRC的发病率有逐年攀升的趋势。鉴于观念和经济水平,我国很多肠癌患者就诊时已经处于进展期,失去了根治性的机会,对于晚期CRC患者来讲,5年生存率降到10%左右。但早期CRC患者预后非常好,可达90%,因此,早期发现是提高CRC患者生活质量和总生存率的根本性手段,而内镜技术的发展,为CRC的早发现提供了新的可能。影响CRC患者预后的主要因素是TNM分期,而肿瘤的远处转移是TNM分期中的决定性因素,转移肿瘤的评估对于评估CRC患者预后、指导治疗和监测治疗疗效以及疾病进展具有较强的现实意义。CRC易于淋巴结、肝脏和肺转移,但其转移机理缺乏深入系统的探讨。除了局部区域淋巴结转移,结直肠癌极易发生肝脏转移和肺转移,据统计肺部转移的发生率约14%。肝脏为肠道血液回流的第一站,肺为第二站。根据解剖学结构,从原发灶来源的癌细胞首先经过血液循环到达肝脏,并种植于肝脏,而后从肝脏转移灶脱落,再次进入血液循环,进入肺小循环,在肺泡毛细血管处停留并种植。有意思的是,有一部分病人,在不发生肝脏转移的情况下,直接出现肺部转移,甚至多次肺脏转移。这种现象提示肿瘤细胞向特定器官转移有着特定的规律和分子基础,阐明这些规律和深入挖掘这些分子基础,对于结直肠癌患者治疗方案的设计具有积极的意义。本研究首先通过测序和免疫组化检测结直肠癌原发灶和肺转移灶来源的肿瘤细胞是否存在特征性蛋白表型和突变的差异;其次,利用全外显子测序技术分析和比较CRC原发灶和转移灶之间的基因突变差异;最后,我们选择差异明显基因之一的MTA3作初步功能分析和验证。我们的发现强调了研究转移的自然过程和治疗对这一过程的影响的重要性。未来通过密集多区域采样和单细胞测序对具有综合治疗信息的配对原发肿瘤和转移瘤的研究可能会为这些过程提供更多的解决方案。尽管如此,仍需要大样本、多中心的临床数据证实我们的发现,还需要更多的功能学实验来阐述关键基因的驱动能力,为临床寻找更好的靶标。第一部分结直肠癌肺转移中突变谱系变化及其临床启迪目的:检测CRC肠癌原发灶和肺转移灶中特征性基因的表达(Ki67和PRR11)和突变(Braf V600E、Kras和Nras),初步探讨解剖部位不同的两个器官内同一个病人的有关肿瘤细胞内特征性基因的异常。方法:构建组织芯片,免疫组化检测Ki67和PRR11在肠癌原发灶和肺转移灶中的表达,Arms法检测Braf V600E、Kras和Nras在两者之间的突变情况。结果:构建了含有13例CRC原发灶、部分淋巴结转移灶和肺转移灶的组织芯片(tissue array)。Ki67在CRC原发灶中的表达率为92.3%(12/13),平均表达强度为13.69,肺转移灶中Ki67的表达率为92.3%(12/13),平均表达强度为12.4。原发灶中表达强度高于转移灶的有5个,一致的有1个,而转移灶中高于原发灶的则有7个。肠癌原发灶中PRR11的表达率为46.2%(6/13),平均表达强度为7.69,肠癌肺转移灶中PRR11的表达率为69.2%(9/13),平均表达强度为18.08。肠癌原发灶中表达强度高于转移灶的有1个,一致的有5个,而肺转移灶中高于原发灶的则有7个。10例可以检测的配对组织中,1例肠癌原发病灶和肺转移灶均存在Braf V600E的突变。2例肠癌原发灶中存在Kras codon12的突变,1例存在codon61的突变,同样这3例病例中肺转移灶也含有类似的突变。然而,在1例肺转移病灶中出现Kras codon12突变,另外一例中肺转移灶中出现Kras codon61的突变,但是这两例病人的肠癌原发灶中不含有上述位点的突变。结论:肺转移灶和肠原发灶之间蛋白表达(Ki67和PRR11)以及基因突变(Kras)的差异提示结直肠癌和肺转移灶之间存在遗传学变异,而这种变异对于临床指导提出了新的启示,对于发生了肺转移的结直肠癌患者,如果能取得肺转移灶,最好重新对这些转移肿瘤细胞进行基因检测,如果出现突变,是不能够采用C225治疗的。第二部分肠癌肺转移过程中突变谱系变化规律目的:对一例连续两次肺转移的肠癌患者的原发灶和多次转移灶来源的肿瘤细胞行全外显子测序,以期获得肠癌肺转移的突变谱系变化。方法:取得患者癌旁非肿瘤粘膜、原发灶、第一次肺转移灶和第二次肺转移灶,提取肿瘤细胞DNA,利用Hiseq平台进行标本的全外显子测序,并进行生物信息学分析。结果:T/N(原发灶/正常组织)中错义突变有183个,In Del 10个;M1/N(第一次肺转移/正常组织)中错义突变有813个,In Del 83个;M2/N(第二次肺转移/正常组织)中错义突变有12049个,In Del 1381个。这些数字说明随着转移次数的增加,基因突变数目呈爆发性上升。功能分析和通路分析也表明第二次肺转移灶中肿瘤细胞突变基因主要落于侵袭和转移相关的分子或者通路,提示第二次转移灶中的肿瘤细胞更具有侵袭能力。结论:肿瘤转移前后基因表型存在巨大异质性,数据证明随着转移次数的增加,肿瘤细胞的突变数目和突变位点个数呈指数级增加;肿瘤细胞的进化现象对于肿瘤患者的临床指导和预防耐药性的发生提供理论方面的支持。第三部分MTA3和突变型MTA3在肠癌中的作用探讨目的:测序结果显示在第二次肺转移灶中出现MTA3的突变,本研究拟明确这种突变会不会是导致MTA3具有多重功能的原因。方法:设计并构建MTA3野生型和突变型质粒,转染肠癌细胞,观察肿瘤细胞功能学(migration和invasion)的影响。利用免疫组化(SP)法检测MTA3在CRC原发灶和肺转移灶中的表达情况。结果:MTA3在正常组织(N)、原发灶(PT)和肺转移灶(LM)中的表达强度分别为:N:7.3±10.2,PT:53.8±71.6,LM:5.4±10.7。统计学分析显示PT中MTA3的表达强度要显著高于正常组织中的表达,但是转移灶中的表达强度要显著低于原发灶中的表达。野生型MTA3和突变型MTA3对肠癌细胞HGC27增殖能力的影响差异不大。野生型MTA3促进肠癌细胞侵袭,而突变型MTA3则使其侵袭能力下降。结论:MTA3在结直肠癌原发灶中高表达,但随着肿瘤转移,其表达消失,可能与基因突变失活有关。野生型MTA3促进肠癌细胞迁移,但突变后这种能力减弱,提示缺失突变或者点突变是导致MTA3功能多样性的潜在因素,是临床潜在靶标,这需要进一步的分子生物学实验及动物体内实验的验证。