近年来，器官移植做为治疗终末期脏器功能衰竭的最佳手段，取得了令人瞩目的成绩。随着外科技术的日臻成熟和新型免疫抑制剂的应用，移植器官的存活时间明显延长，器官移植已广泛开展。目前以免疫抑制剂为主的很多药物能较好的防治移植排斥反应，保证移植物在一定时间内的存活，但这些药物往往具有诱发肿瘤、机会菌感染、移植物散失功能等毒副作用，而且价格昂贵需终身服药，给患者的生理、心理及经济上带来沉重压力。同种移植排斥仍是目前器官移植领域所遇到的最大难题。因此，研究移植排斥反应机理及如何有效控制移植排斥反应，是提高器官移植成功率的关键；而诱导受体抗原特异性免疫耐受是同种器官移植追求的目标。在诱导免疫耐受过程中一个重要的决定因素是抗原递呈细胞(Antigen presenting cells，APC)的状态，而树突状细胞(Dendritic cells，DC)做为一类功能最强的专职抗原递呈细胞，在识别和递呈抗原、启动免疫应答、诱导移植排斥反应中起着重要的作用。DC成熟状态的不同不仅决定着T细胞的激活，而且还决定了T细胞免疫应答的最终发展方向。而采用不成熟DC是有效诱导移植免疫耐受的方法之一。 表观遗传学(Epigenetics)是指研究基因组DNA序列不变的情况下在表型上具有稳定的、可遗传的(或有潜在可遗传性质)的变化。在各种组蛋白修饰中，组蛋白乙酰化修饰在基因活性的调节中扮演着重要的角色。组蛋白乙酰化和去乙酰化分别由组蛋白乙酰基转移酶(Histone acetyltransferases，HAT)和组蛋白去乙酰基酶(Histone deacetylases，HDAC)催化完成，是一个动态的过程。丁酸钠(Sodium butyrate)是一个天然的HDAC抑制剂(Histone deacetylasesinhibitor，HADCi)，研究表明丁酸钠可以显著的影响PMBC来源的分化和成熟过程，并诱导其处于不成熟状态，从而诱发机体抗原特异性免疫耐受方面。研究发现，DC产生的不同免疫效应与其所处的状态和微环境密切有关，而吲哚胺2,3双加氧酶(Indoleamine 2，3-dioxygense，IDO)是一种主要存在于APC中的含有血红素的细胞内酶，是色氨酸向犬尿氨酸和喹啉酸的降解过程中的限速酶，可能在DC诱导免疫耐受的途径中发挥了重要的作用。细胞因子信号转导抑制分子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)是由细胞因子诱导产生的，JAK—STAT信号通路中非常重要的负调控蛋白，通过抑制细胞因子信号转导调节机体对细胞因子的过度刺激。许多研究也表明SOCS是固有免疫和获得性免疫中非常重要的生理性调节物质，可以促进或抑制树突状细胞的激活，并参与T细胞的分化和免疫调控。 本研究的目的：(1)通过不同浓度丁酸钠和不同培养时间体外诱导PMBC为未成熟DC，探讨制备未成熟DC的新方法，并为进一步深入研究DC分化过程中的表观遗传学机制提供依据。(2)探讨丁酸钠对未成熟树突状细胞IDO、SOCS-1、SOCS-2、SOCS-3表达的调控，揭示丁酸钠诱导的未成熟DC在免疫耐受中的作用与分子机制。 第1章丁酸钠诱导未成熟树突状细胞的分化及其免疫学特性研究 　　1.研究方法抽取健康志愿者(n=5)外周血分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，将PBMC密度调到5×109cells/L，加入25cm2培养瓶，37℃、5％CO2培养2h后，洗去非贴壁细胞。贴壁细胞用含1×106U/L rhGM—CSF和5×105U/L人重组IL-4的RPMI-1640完全培养基培养，第3d全量换液。第6d时收获未成熟DC，按1×106 cells/孔接种24孔板，每孔体积1ml，加入含rhGM-CSF和IL-4的完全培养液，并分组诱导DC分化。(1)对照组，仅用含rhGM-CSF和IL-4的完全培养液，不加促成熟因子LPS；(2)脂多糖(LPS)诱导组，加入LPS 1mg/L；(3)组：丁酸钠诱导组，丁酸钠诱导组按照丁酸钠浓度的不同，分为3组分别诱导。A组：加入丁酸钠1.0 mmol/L；B组：加入丁酸钠0.75 mmol/L；C组：加入丁酸钠0.5 mmol/L;(4)组：丁酸钠、脂多糖混合诱导组，加入丁酸钠1.0 mmol/L和LPS 1 mg/L同时诱导分化。各组在诱导24h和48h后分别收获DC，流式细胞仪进行细胞表型分析；并采用Annexin V/PI双染色法进行细胞凋完的流式检测。同时收集培养上清，-80℃保存，用于检测IL-12(p40)、IL-10、IFN-γ含量。 2.结果在丁酸钠诱导下，各组DC表面的成熟标志(CD80、CD83、CD86)均显著下调，丁酸钠浓度越高下调越明显，随着培养时间的延长，各组DC表面的成熟标志均显著下调；但是细胞的凋亡率也同时上升。负性调节表型中LPS诱导组DC表达TLR3、TLR-4明显低于丁酸钠诱导组；而B7-H1、B7-DC则均明显高于丁酸钠诱导组。丁酸钠可使DC减少IL-12、和IFN-γ/的分泌；增加IL-10的分泌。第2章丁酸钠对未成熟树突状细胞的IDO、SICS-1、SOCS-2、SOCS-3表达的调控1.研究方法DC的培养参照第1章方法：第6d时收获未成熟DC，按1×106 cells/孔接种24孔板，每孔体积1ml，加入含rhGM-CSF和IL-4的完全培养液，并分组诱导DC分化。(1)对照组，仅用含rhGM-CSF和IL-4的完全培养液，不加促成熟因子LPS；(2)脂多糖(LPS)诱导组，加入LPS 1mg/L；(3)组：丁酸钠诱导组，丁酸钠诱导组按照丁酸钠浓度的不同，分为3组分别诱导。A组：加入丁酸钠1.0 mmol/L：B组：加入丁酸钠0.75 mmol/L；C组：加入丁酸钠0.5 mmol/L； (4)组：丁酸钠、脂多糖混合诱导组，加入丁酸钠1.0 mmol/L和LPS 1 mg/L同时诱导分化。各组在诱导24h和48h后分别收获DC提取RNA，同时收集培养上清，-80℃保存，用于检测IL-12(p40)、IL-10、IFN-γ含量。 2.结果 通过定量Real-Time PCR(qRT-PCR)反应检测各组IDOmRNA的表达情况。结果显示无论是成熟组、对照组和丁酸钠组，均可见IDO的表达，但是LPS组的IDO表达量明显低于丁酸钠组，有统计学意义(p<0.05)；丁酸钠能够增加DC的IDOmRNA的表达，并且随着丁酸钠浓度的增加和培养时间的延长而增加。这个结果说明不同成熟状态的DC对于刺激T细胞的增殖作用的差异可能和IDO的表达程度有关。对于imDC而言，Na-B组的IDO表达水平明显高于对照组，说明丁酸钠可以促进imDC IDO的表达。通过qRT-PCR反应检测各组发现SOCS-1、SOCS-2、SOCS-3 mRNA的表达情况。结果显示无论是成熟组、对照组和丁酸钠组，均可见SOCS-1、SOCS-2、SOCS-3 mRNA的表达。结果显示丁酸钠组SOCS-1 mRNA的表达明显低于促成熟组(LPS)；结果显示丁酸钠组SOCS-2、SOCS-3 mRNA的表达明显高于促成熟组(LPS)。丁酸钠能够显著地促进imDC的SOCS-2、SOCS-3 mRNA的表达；丁酸钠能够明显的抑制imDC的SOCS-1 mRNA的表达。 结论 1.在体外培养条件下，丁酸钠可以明显抑制PBMC来源的DC的成熟。表现为DC成熟表型的明显下调，而且随着丁酸钠浓度的升高和诱导时间的延长可以使DC的成熟表型进一步降低，但是会增加DC的凋亡率；实验提示以丁酸钠浓度0.75 mmol/L和培养48h为最佳培养方法。 2.丁酸钠可使DC减少IL-12、和IFN-γ的分泌；增加IL-10的分泌。 3.丁酸钠诱导的DC可稳定维持不成熟状态，不能被LPS促成熟因子再次激活。 4.无论DC的成熟状态如何，均有IDO、SOCS-1、SOCS-2、SOCS-3的表达，imDC中的IDO、SOCS-2、SOCS-3 mRNA的表达量高于mDC；imDC中的SOCS-1表达量低于mDC。 5.丁酸钠增强imDC表达高水平IDO，通过降解细胞微环境中的色氨酸，使细胞处于一种“色氨酸饥饿”状态，从而发挥对T细胞增殖的抑制作用。 6.丁酸钠显著上调imDC表达SOCS-2、SOCS-3；抑制SOCS-1的表达，这对促进Th0细胞向Th2类细胞分化的起到了重要的作用。