【摘 要】
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目的研究miR-26b对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,m ESCs)多能性及其分化的调控作用。方法1.实时荧光定量PCR检测miR-26簇前体在m ESCs和小鼠胚胎成纤维细胞(mo
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目的研究miR-26b对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,m ESCs)多能性及其分化的调控作用。方法1.实时荧光定量PCR检测miR-26簇前体在m ESCs和小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)中的表达。2.实时荧光定量PCR检测胚状体(embryoid body,EB)形成过程中成熟miR-26b的表达,并且比较miR-26b在m ESCs与MEF中的表达。3.CCK-8方法检测miR-26b对m ESCs增殖能力的影响。4.流式细胞术测定miR-26b对m ESCs细胞周期与凋亡的影响。5.使用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色试剂盒检测miR-26b对m ESCs中碱性磷酸酶活性的影响。6.实时荧光定量PCR检测miR-26b对m ESCs中多能性转录因子(Oct4、Sox2和Nanog)m RNA表达的影响。7.使用蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测miR-26b对m ESCs中三个关键转录因子的蛋白表达影响。8.用体外模型观察转染pc DNA-pre-miR-26b对m ESCs细胞群落形态的影响。9.实时荧光定量PCR检测miR-26b对视黄酸(retinoic acid,RA)诱导以及激活素A(activin A,AA)诱导m ESCs的胚层标志物表达的影响。10.免疫荧光法检测在m ESCs分化过程中,miR-26b对中胚层和内胚层标志物(α-SMA和GATA4)的影响。11.实时荧光定量PCR检测miR-26b前体在三个胚层衍生的典型组织器官中的表达情况。结果1.m ESCs中,miR-26b的前体在miR-26簇群表达最高。MEF中所有miR-26前体均上调,其中pre-miR-26b上调幅度最大(上调约10倍)。2.成熟的miR-26b在EB形成过程中从第2天到第6天明显上调,并且成熟miR-26b在MEF中的表达水平明显高于其在m ESCs中的表达水平。3.miR-26b的过表达抑制m ESCs增殖,并显示miR-26b过表达诱导m ESCs于细胞周期的G1期阻滞,miR-26b不影响m ESCs的凋亡。4.ALP染色结果表明miR-26b导致m ESCs中ALP活性降低。5.过表达miR-26b导致m ESCs中多能性标志物(Oct4、Sox2和Nanog)的表达水平降低。6.体外模型研究miR-26b对m ESCs分化的影响,在miR-26b诱导的第4天观察到了分化的细胞,m ESCs的细胞集落开始变平并从细胞群落边缘分离。随后,大多数细胞群落失去了典型的单型形态,形成了具有不同形态的三维结构。7.RA处理增加了外胚层标记物Nestin的表达。在miR-26b过表达的情况下,该诱导被抑制。与此相反,miR-26b促进AA诱导的中、内胚层标记物的表达,包括α-SMA和GATA4。8.miR-26b的过表达使m ESCs细胞群落中存在α-SMA阳性细胞,这些细胞6天后约占细胞总数的50%。miR-26b也能显著诱导GATA4。9.miR-26b前体在主要由中胚层和内胚层衍生而来的器官中高表达,尤其是肠、胃和肝脏,在脑和脊髓等外胚层衍生组织中表达相对较低。结论本研究证实miR-26b是miR-26家族调控m ESCs分化的潜在关键成员。miR-26b抑制m ESCs的多能性及自我更新,并且miR-26b可以促进m ESCs向中内胚层分化。
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