单核及巨噬细胞是天然免疫系统的主要效应细胞，通过分泌多种细胞因子等调节对入侵病原体的反应，但是过强的反应，尤其是严重创伤及大手术后等，机体的免疫机能下降的情况下，可出现脓毒症(Sepsis)、脓毒性休克。高达50％的脓毒症病人是由革兰阴性菌感染所致，脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，即内毒素是革兰氏阴性菌的主要致病成分；极微量内毒素即可使机体首先通过天然免疫系统对其做出反应。机体免疫细胞对LPS的识别机制极为复杂，1990年发现的CD14是LPS的识别受体，但由于CD14分子没有跨膜部分，自身不能将信号导入细胞内，还需要其它膜结合分子协同作用。TLR4及MD-2蛋白的发现是对LPS受体识别机制研究的突破性进展，MD-2与TLR4的胞外区相偶联，因其是一个只含有160个氨其酸的分泌蛋白，具有分子量小，核酸片段短，且为可分泌型等特点，对MD-2的调控更易于操作，因而成为治疗内毒素休克十分有潜力的靶点之一。研究其在内毒素跨膜信号转导中的作用及其与TLR4、CD14之间的关系，是确定对MD-2进行调控有无深远意义的基础。 LPS对人外周血单核巨噬细胞的活化有赖于其受体基因的表达谱，虽然有一些对CD14，TLR4基因表达受LPS调节的报道，但报道的结果并不一致，且很少有对MD-2基因受LPS调节的报道；更没有同时报道MD-2／TLR4／CD14基因在同一标本内受LPS调节的研究。核糖核酸酶保护法是一种可同时在同一标本内检测多种基因表达的先进方法，且其重复性、客观性都较强，但是需要构建相关基因的检测模板组，因而本研究率先构建了该检测模板组，并成功地应用于检测人外周血单核细胞上关注的三种基因的表达。为进一步明确MD-2在单核细胞LPS信号转导中的作用，可以通过增强或抑制其功能的方式，检测细胞LPS信号功能的变化，从而反映其作用，并为确定可否做为调控靶点提供相应的实验的依据。通过基因转染的方法将MD-2或其功能突变体导入受体细胞，可使细胞增强表达MD-2或阻抑MD-2的功能。因而，我们首先根据相关报道，成功地构建了MD-2的功能失活表达载体，而后将正常功能的MD-2表达载体及新构建的功能突变体导入人单核细胞株THP1内，观察对LPS效应的影响。为第三军医大学博士研究生论文明确MD一2所起的作用的机制及其与TLR4及CD14之间的关系，通过观察它们与LPS的结合能力及不同组合的转染细胞对LPS的不同反应能力，以探讨MD一2发挥其作用的可能机制。 因此拟从以下三部分进行研究:1.分离提取人外周血单核细胞，以LPS刺激，核糖核酸酶保护法检测MD一2、TLR4、CD14 mRNA表达变化的规律。2.构建MD一2功能突变体，将正常功能的MD一2及其功能失活突变体转染进单核细胞株THPI内，以LPS刺激后，观察细胞活化功能的变化，以此反映MD一2在LPS信号转导中所起的作用。3.将以上三种基因表达质粒以不同组合转染HEK293细胞，而后应用LPS刺激转染细胞，观察细胞NF一kB被活化的改变，及荧光素标记的LPS与转染细胞的结合能力，以此来探讨MD一2发挥其作用的可能机制。 主要结果及结论如下: 一、成功地构建了用于核糖核酸酶保护法的模板组:为在基因水平检测MD一2/TLR4/C D14表达变化奠定了基础。核糖核酸酶保护法具有灵敏度高，稳定性及重复性好等特点，因而构建了该模板组，并成功地用于检测人外周血单核细胞上述三种基因的表达。 二、人外周血单核细胞上述三种基因的表达规律:人外周血单个核细胞在受到LPS刺激后，TLR4，MD一2，CD14 mRNA在刺激后15min一30min即可以明显增加，在1一3h则有一过性降低，之后恢复。检测结果提示:细胞作为对LPS的反应，迅即增强相关受体基因的表达，但作为机体自我保护的一种反应，为避免过强的炎症反应，能反馈性的适当抑制和调节LPS受体基因的表达。另外，因三者的表达丰度存在明显的差异，由于缺乏更多的证据，我们只能推测表达最低的MD一2可能在LPS信号中具有更为特异的作用。 三、构建了MD一2功能突变体:根据相关文献报道，在人MD一2蛋白分子的第95位氨基酸，在由半肤氨酸突变为酪氨酸后功能失活。我们应用 PCR定点突变的方法成功地构建了该突变体。 四、MD一2可调节细胞对LPS的反应能力:转染正常功能的MD一2表达载体后，THPI细胞NF一沼活性及细胞上清内TNF一a分泌增强。相反，转染MD一2的功能突变体后，LPS对THPI细胞激活效应明显减弱，表现为NF一沼活性及TNF一a分泌明显降低。进一步提示，MD一2在LPS对单核细胞的激活效应中具有重要的地位，而且有望成为调节炎症反应强度的靶点之一。 五、MD一2可明显增强细胞经TLR4对LPS的结合能力:单独或以各种不同的组合方式将三种受体基因转染进HEK293细胞内，以FITC一LPS与细胞共同孵育，应用第三军医大学博士研究生论文流式细胞仪的方法进行检测，发现MD一2可以直接与LPS结合，虽然这种结合能力较低，但是却可以明显促进LPS与TLR4及CD14的结合。 六、在LPS对细胞NF一kB的活化过程中，需要MD一2/TLR4/CD14三种分子的共同参与。虽然MD一2可明显促进TLR4与LPS的结合，且TLR4/MD一2共同转染后细胞对LPS有较强的结合能力，但是与三种基因共