【摘 要】
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由于抗生素在畜牧业及食品生产中持续性以及预防性或过度使用,使得细菌为了克服抗生素的治疗效果而不断的发生突变进而造成细菌耐药性的产生以致于形成多重耐药菌。而由细菌严重耐药造成的各类疾病的感染率正在继续上升,因此细菌耐药已逐渐对全球的生物群体健康产生了严重的威胁。近年来,随着无抗养殖的号召在行业里得到越来越多人的认可,作为抗生素的有效替代选择---噬菌体的应用逐步受到重视。与此同时,目前人工改造噬菌体
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由于抗生素在畜牧业及食品生产中持续性以及预防性或过度使用,使得细菌为了克服抗生素的治疗效果而不断的发生突变进而造成细菌耐药性的产生以致于形成多重耐药菌。而由细菌严重耐药造成的各类疾病的感染率正在继续上升,因此细菌耐药已逐渐对全球的生物群体健康产生了严重的威胁。近年来,随着无抗养殖的号召在行业里得到越来越多人的认可,作为抗生素的有效替代选择---噬菌体的应用逐步受到重视。与此同时,目前人工改造噬菌体的理论和技术正在不断的进行优化并已取得了一定的进展,使基因工程改造噬菌体在临床应用方面具有更高的安全保障及应用潜力。本研究通过丝裂霉素C诱导及双层平板噬斑法以一株野生型多重耐药大肠杆菌作为宿主菌,成功分离纯化到一株λ温和性噬菌体并将其命名为PEA3b,结合BAC+Red ET反向遗传操作系统构建了以噬菌体两端作为同源臂的p BAC11-15A-ccd B-HA质粒,将该质粒与携带NDM-1耐药基因识别靶点的CRISPR/cas9质粒及λ噬菌体全基因在Gbdir中线线重组,经特异性引物PCR及凝胶电泳验证后,完成工程λ噬菌体基因组的连接。将获得的工程噬菌体经从C100工程菌大量增殖后作用于野生型耐药宿主菌,结合荧光定量及野生型耐药宿主菌耐药表型的变化来评估工程温和性噬菌体对耐药细菌的耐药基因进行定向的剪切与消除效果。结果显示:(1)λ温和性噬菌体PEA3b经两次纯化后可在双层平板上形成透亮,均一的圆形噬菌斑;用磷钨酸负染法经投射电镜观察该噬菌体具有50nm左右大小的头部及末端有细小尾丝的非收缩尾;其最佳感染复数为10-1;其宿主谱较窄,仅能侵染并裂解同批次临床分离的3株携带NDM-1多重耐药大肠杆菌(3/20)。(2)经高通量测序结果显示,该噬菌体的全基因组全长为52489 bp,GC平均含量为49.40%。在全基因序列中进行NDM-1基因的查找,结果显示该噬菌体的基因内未携带NMD-1耐药基因。(3)使用最佳MOI值的工程噬菌体与野生耐药细菌进行作用,结合荧光定量及野生型耐药宿主菌耐药表型验证结果显示,工程λ噬菌体可一定程度上降低野生耐药菌群中NDM-1耐药基因的含量,恢复部分碳青霉烯类抗生素对细菌的敏感性。综上所述,该工程λ噬菌体可从一定程度上消除细菌耐药性的产生与传播的基础。并为以后消除其他耐药基因的工程噬菌体构造打下理论基础与技术支撑。
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