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目的:代谢适应性对于肿瘤的进展至关重要,Warburg效应中癌细胞优先利用乳酸而不是葡萄糖产能时,会模拟葡萄糖饥饿造成细胞自噬的发生。然而,乳酸在细胞自噬的诱导中是否发挥作用仍不清楚,因此,本文主要探讨乳酸对细胞自噬的作用及分子机制。材料与方法:选取人肺癌细胞A549、H1299和H1688细胞作为研究对象。(1)通过Western blot探究乳酸在诱导细胞自噬中beclin1、p62和LC3蛋白表达量的变化;(2)通过两种自噬抑制剂3-MA和HCQ探究是否能逆转乳酸诱导的自噬;(3)通过免疫荧光分析自噬体的形成;(4)通过转染beclin1 cDNA和beclin1siRNA,探究乳酸是否通过beclin1诱导细胞自噬;(5)通过双荧光素酶报告基因实验和CHX半衰期实验,探究乳酸在转录前还是转录后调控beclin1蛋白表达;(6)通过转染E3泛素连接酶NEDD4和CO-IP实验,Western blot检测beclin1的蛋白量;(7)通过解偶联剂FCCP和乳酸联用,Western blot检测线粒体自噬相关蛋白parkin、beclin1、LC3蛋白表达量;(8)转染beclin1 cDNA和beclin1 siRNA,分别提取线粒体蛋白并通过Western blot检测parkin蛋白表达量以及免疫荧光共定位实验观察parkin移位情况;(9)通过MTT实验和平板克隆实验,探究beclin1的生物学功能。结果:(1)不同浓度乳酸处理人肺癌细胞A549、H1299和H1688后,自噬相关蛋白beclin1和LC3蛋白表达量均明显上升,p62蛋白表达量明显下降;(2)自噬抑制剂3-MA处理后,beclin1和LC3蛋白表达量均下降;自噬抑制剂HCQ处理后,p62和LC3蛋白表达量均累积,表明自噬流受损;(3)免疫荧光实验结果表明乳酸作用下,红色荧光斑点增多绿色荧光斑点减少,自噬流较顺畅;(4)在人肺癌细胞A549、H1299和H1688中,转染beclin1 cDNA后LC3蛋白表达量上升,p62蛋白表达量下降;转染beclin1 siRNA后LC3蛋白表达量下降,p62蛋白表达量上升;(5)双荧光素酶报告基因结果显示在A549、H1299和H1688里,乳酸处理后对beclin1启动子活性无明显变化;将CHX和乳酸联用后,beclin1的降解时间由原先的6小时减缓为12小时;(6)转染E3泛素连接酶NEDD4 cDNA后发现,NEDD4促进了beclin1的降解;CO-IP实验结果显示NEDD4作用下,beclin1泛素化水平增加,而乳酸处理后这种泛素化被抑制;(7)解偶联剂FCCP处理后,线粒体自噬相关蛋白parkin、beclin1、LC3蛋白表达量增加,联用乳酸后增加更明显;(8)转染beclin1 cDNA后提取线粒体蛋白和胞质蛋白,发现beclin1明显促进parkin的移位,转染beclin1 siRNA后明显抑制parkin移位;免疫荧光共定位也得到类似的结果;(9)MTT实验表明过表达beclin1后促进细胞的生长,敲降beclin1后则抑制细胞的生长;平板克隆形成实验表明过表达beclin1后促进细胞的集落形成数,敲降beclin1后则抑制细胞的集落形成数。结论:本课题发现了乳酸作为有氧糖酵解的产物,可能通过促进细胞线粒体自噬来保护细胞,从而促进了肿瘤的发生与发展,也为乳酸与自噬的靶向治疗提供了临床基础。