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胶质瘤是一种常见的中枢神经系统肿瘤,尽管目前应对肿瘤有多种治疗措施,但恶性胶质瘤患者的预后仍较差,因此寻找新型抗肿瘤药物依然具有重要意义。蟾毒灵是中药蟾酥的主要成分,是从中华大蟾蜍分泌的毒液中提取的,目前,对蟾毒灵抗肿瘤机制的研究多集中在各种类型的肝癌细胞,其对胶质瘤细胞的作用尚未见报道。本实验的目的是研究蟾毒灵对胶质瘤的生长是否具有抑制作用,并探讨其相应的分子机制。 用不同浓度蟾毒灵作用U87MG细胞24或48小时,选取各种方法处理,观察处理后的细胞形态学和分子生物学特性的变化。细胞增殖抑制实验(MTT)观察不同处理对细胞增殖的影响;流式细胞术检测ROS水平的变化及细胞凋亡情况;吖啶橙和MDC染色观察自噬泡的存在,从而检测细胞自噬水平的变化;脂质体转染si-RNA以降低某一基因的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同处理后凋亡、自噬及内质网应激相关蛋白表达水平的变化。 MTT结果表明,用不同浓度蟾毒灵处理U87MG细胞24和48小时,蟾毒灵可有效抑制胶质瘤细胞的增殖。Bax/Bcl-2比值升高,细胞色素c及CleavedCaspase-3和Cleaved PARP的上调表明,蟾毒灵可诱导U87MG细胞发生线粒体途径凋亡。 蟾毒灵可激活自噬的证据包括酸性自噬泡的形成、自噬溶酶体的增加及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的上调。进一步的实验表明,蟾毒灵诱导自噬的机制与其降低细胞内ATP含量、激活AMPK,抑制mTOR及其下游蛋白4EBP1和p70S6K有关。 用自噬抑制剂3-MA抑制自噬可增强蟾毒灵诱导的细胞凋亡并促进凋亡蛋白Cleaved Caspse-3及Cleaved PARP的表达。干扰自噬基因Beclin1或Atg5后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ灰度比降低,而凋亡蛋白cleaved PARP活性增强。这些结果说明自噬在蟾毒灵诱导的细胞凋亡中发挥保护性作用。 蟾毒灵诱导U87MG细胞发生内质网应激的证据包括非折叠蛋白反应(UPR)感受蛋白PERK、IRE1α、eIF2α的磷酸化水平升高和内质网应激标志蛋白GRP78和GRP94的表达量的上调。CHOP和内质网应激凋亡特有的Caspase4的激活,表明蟾毒灵还可诱导U87MG细胞发生内质网应激所介导的凋亡。此外,用si-CHOP抑制CHOP的表达可使蟾毒灵诱导的细胞凋亡率下降,这进一步说明了内质网应激在蟾毒灵诱导凋亡中的重要作用。周内质网应激抑制剂TUDC或干扰内质网应激蛋白eIF2α、CHOP的表达,可部分抑制蟾毒灵诱导的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的上调,说明内质网应激发生于自噬之前,并且PERK/eIF2α/CHOP途径参与了对自噬的调节。 综上所述,本研究的主要结论如下:蟾毒灵可抑制胶质瘤细胞的增殖,并通过线粒体途径和内质网应激引起凋亡。蟾毒灵通过AMPK/mTOR/p70S6K-4EBP-1通路诱导U87MG细胞自噬。内质网应激特别是PERK/eIF2α/CHOP通路参与了蟾毒灵诱导的自噬反应。抑制自噬效应有助于增强蟾毒灵对U87MG细胞的促凋亡活性,提高肿瘤细胞的敏感性。