角蛋白(Keratin)是一种广泛存在于自然界中的硬性蛋白,主要存在于各种动物的毛发、鳞片、羽毛、蹄、角等结构中。角蛋白化学结构稳定,不溶于水,也不能被一般的蛋白酶,如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解。从微生物中纯化的角蛋白酶活性很强,可以水解多种难降解的纤维蛋白,如角蛋白、弹性蛋白和胶原等,具有广泛的应用前景。 本研究确定了角蛋白降解菌弗氏链霉菌k11(Streptomyces fradiae var.k11)有利于蛋白酶纯化的最佳产酶培养条件。通过蛋白酶的同工酶电泳,从角蛋白降解菌弗氏链霉菌k11的培养液上清中,发现了六种分泌的蛋白酶,初步摸清了弗氏链霉菌k11的分泌蛋白酶酶系。 通过RT-PCR,初步研究了弗氏链霉菌k11的六种蛋白酶基因在羽毛培养基和高氏1号培养基中,不同发育时期的表达情况。研究结果表明,所研究的几种分泌蛋白酶的表达均为组成型表达,与生长环境中是否存在角蛋白无关。 纯化了弗氏链霉菌k11所产的两种分泌蛋白酶,并进行了部分氨基酸序列测定。 构建了弗氏链霉菌k11的基因文库。利用多种基因克隆技术组合,克隆得到了六种蛋白酶基因sfp1,sfp2,sfp3,sfap,sfp4和sfp5(其中四个基因sfp1,sfp2,sfp3和sfap已在EMBL注册,注册号分别为AJ784159,AJ784940,AJ810091和AJ781828)。 在已克隆得到的六种分泌蛋白酶中,有三种(SFP1,SFP3,SFAP)与已报道的同源性最高的蛋白酶的DNA同源性在80%以下,氨基酸同源性在72%以下,是三种新发现的蛋白酶基因。 克隆的另一蛋白酶基因sfp2,其成熟蛋白的氨基酸序列与已报道的Sfase-2同源性高达99.5%,基本上可认为是同一蛋白酶,根据我们及前人的研究结果,这一蛋白酶具有较高的角蛋白酶活性,是一极具应用潜力的蛋白酶,但前人的工作只得到了成熟蛋白的部分基因序列(编码成熟蛋白的576bp中的492bp),蛋白酶的pro肽、信号肽编码序列及基因侧翼序列均未得到,而且未验证基因功能,而蛋白酶的pro肽对蛋白酶的活性表达具有重要作用。本研究从蛋白纯化出发,经蛋白测序,进而调出部分基因序列,通过构建基因文库,首次获得了包括信号肽、pro肽编码序列在内的完整的基因序列。 构建了组成型和蔗糖诱导型分泌表达的枯草芽孢杆菌表达系统,为今后开发利用上述基因建立了初步的表达技术平台。 在大肠杆菌BL21中表达了sfp2和sfp1基因,验证了基因的功能,证明克隆的sfp2和sfp1基因是蛋白酶基因,为今后对这些基因的开发利用打下了良好的基础。在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中均表达了sfp2基因的成熟蛋白基因和蛋白酶原基因,证明蛋白酶的pro肽部分对蛋白酶的活性表达起着重要的作用。 测定了在大肠杆菌中表达的蛋白酶SFP2的部分酶学性质,发现SFP2对角蛋白具有较强的底物专一性,是一种具有较强角蛋白酶活性的蛋白酶。研究发现,还原剂的存在,能极大地提高其角蛋白酶活性。克隆和表达的SFP2具有较大的应用潜力。