柑橘(Citrus)是世界性的大宗水果,我国则是世界上第一大柑橘生产国。与其他作物一样,柑橘真菌性病害种类繁多,始终困扰着柑橘产业的健康发展,而正确鉴定病害的病原菌种类和优势种是开展病害发生规律和防治技术研究的基础。随着分子系统学在植物病原真菌分类鉴定中的广泛运用,过去基于寄主范围和形态学特征建立起来的分类阶元正面临着重大的变动,利用形态学、寄主范围、生理生化特性和基于多基因系统进化分析相结合的分类鉴定法已得到广泛的认同。刺盘孢属(Colletotrichum spp.)、间座壳属(Diaporthe spp)、球腔菌类(" Mycosphaerella " spp.)和链格孢属(Alternaria spp.)是柑橘上的重要病原真菌,分别引起炭疽病和花后落叶病,黑点病、树脂病和褐色蒂腐病,脂点黄斑病和链格孢褐斑病和黑腐病,这些病害症状多变,而国际上对柑橘上的这类病害病原的系统性研究缺乏。本研究较为系统地收集从中国主要柑橘产区,主要栽培柑橘上的刺盘孢属、间座壳属、球腔菌类群和链格孢属真菌,结合形态学和基于多基因系统进化分析的方法,对其进行种类鉴定,以期明确这些病害的确切病原种类和优势种,研究结果报告如下：1.中国柑橘相关的Colletotrichum属真菌的种类和优势种从有症状和无症状的柑橘叶片、枝梢和果实材料(包括少量金橘材料)上,总共收集312株刺盘孢属(Colletotrichum)真菌菌株。对这些菌株进行形态学研究,并将其分为4个形态学组群。从4个形态学组群中分别选取代表菌株24株,9株,2株和3株,分别扩增多基因序列包括肌动蛋白(ACT),β-微管蛋白(TUB),钙调蛋白(CAL),3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),谷氨酰胺合成酶(GS)基因和核糖体转录间隔区(ITS)进行系统进化分析。所有来自柑橘的刺盘孢属的菌株均被归入到4个复合种中,即Co. gloeosporioides复合种,(Co. boninense复合种,Co. acutatum复合种和Co. truncatum复合种。位于Co. gloeosporioides复合种中的菌株分为两个种,分别是Co. gloeosporioides和Co.fructicola;来自Co.boninense复合种的菌株同样分为两个种,分别是Co. karstii口一个新种Co.citricola;位于Co. acutatum复合种中的菌株代表一个新种Co. citri;位于Co.truncatum复合种中的菌株就是Co. truncatum。Co. gloeosporioides为柑橘上刺盘孢属真菌最主要的种群,占全部菌株的92%(287株)。2.中国柑橘相关的Diaporthe属真菌的种类和优势种本实验中,总共获得柑橘致病相关的间座壳属(Diaporthe)真菌菌株119株。其中,72株菌株分离自带有黑点病症状的枝梢、叶片和果实,30株菌株分离自带有褐色蒂腐病的果实,17株来自枯死的柑橘枝干和主干。这些菌株来源地包括陕西、浙江、广西、福建、广东、江西、湖南、重庆和上海等柑橘产区。另外从美国佛罗里达得到Diaporthe citri菌株27株。通过形态学研究和基于四个DNA位点(ITS, TUB,转录延伸因子基因TEF和CAL)序列的系统进化分析,所有柑橘致病相关的间座壳属菌株被归入到三个类群。Diaporthe citri是其中最主要的类群(88.2%,105株),并将其和美国佛罗里达得到的菌株进行比较。两个与D.citri不同的类群被描述为新种D. citriasiana(?)D. citrichinensis。间座壳属真菌同样代表植物上内生型和腐生型真菌的重要组成部分,但是相对于病原菌的研究来说,我们对它们知之甚少。在后续的研究中,我们重点分析了58个间座壳属真菌菌株,其中44个为柑橘上的内生型菌株。通过对四个基因位点(ITS,TEF,TUB,组蛋白基因HIS)序列结合分析,所有菌株被归入到16个类群中。这些类群包括一些已知的种群,如Diaporthe arecae复合类群,D. citri, D. citriasiana, D. citrichinensis, D. endophytica, D. eres, D. hongkongensis和D. sojae。另外,有7个类群被描述为新种Diaporthe biconispora, D. biguttulata, D. discoidispora, D. multigutullata, D. ovalispora, D. subclavata和D. unshiuensis。3.中国柑橘相关的"Mycosphaerella”真菌的种类和优势种从福建、广东、贵州、湖南、江西、云南、浙江和广西采集带有脂斑病、黄斑病、褐色小圆星以及其它症状的柑橘叶片和果实材料。从中总共分离到82株球腔菌类真菌,另外,从其它国家得到8株相关菌株。基于形态学研究和基于多基因的系统进化分析(ITS,ACT,TUB,核糖体大亚基基因LSU, TEF),这些菌株被归入到6个不同的属群中,分别是Cercospora, Pallidocercospora, Passalora, Pseudocercospora, Verrucisporota和Zasmidium。所有这些属群中,只有来自Zasmidium中的真菌培养条件下可以产生分生孢子,所以被选择与其近似种群进行进一步比较。最后,从柑橘上的Zasmidium属中界定出4个种群,即来自印度尼西亚的Zindonesianum,来自中国柑橘果实上的Z. fructico la和Zfructigenum,以及Z. citri-griseum。 Z. citri-griseum具有世界性分布,它不但发生于柑橘,还发生于刺槐、桉树、芭蕉等其它植物上。4.中国柑橘链格孢褐斑病菌(Alternaria alternata)的遗传多样性在中国,柑橘褐斑病病原菌(Alternaria alternata sensu lato)于2010年首次被报道于云南省。之后,柑橘褐斑病相继在中国其他省市报道发生,包括重庆、浙江、湖南、广东和广西。从2010到2012,我们从四个橘类品种和一个杂柑品种上总共收集86个链格孢菌株。通过致病性实验证实,这些菌株中85%能够对桠柑叶片致病。基于多聚半乳糖醛酸酶基因(endoPG)部分序列以及结合该基因和两个匿名区段(OPA1-3,OPA2-1)序列进行的系统进化分析证实,来自中国的所有菌株被归入到已经报道的三个柑橘链格孢褐斑病病原菌进化支系中的两个。其中的进化支系3包括来自土耳其和以色列的参考菌株,进化支系1包括来自美国佛罗里达的参考菌株,并没有来自中国的菌株被归入进化支系2。另外,24个来自中国湖南、广东和广西的菌株被归入一个新的进化支系,该支系还包括感染草莓和日本梨的交链格孢菌株。通过对本实验结果的分析,发现中国柑橘链格孢褐斑病病原菌遗传多样性并不比其他国家和地区更丰富,推测中国并不-定是链格孢褐斑病的起源中心,其起源中心可能发生在东南亚的一些其他国家。通过对我国柑橘上4类重要病原真菌较为系统的研究,我们发现柑橘上刺盘孢属、间座壳属、球腔菌类群真菌具有不同的程度的种类多样性,和柑橘上交链格孢属真菌的种内变异丰富。利用基于多基因的系统进化分析,可以清楚地将这些真菌不同的种群区分开来。同时,本研究详细描述种群间的形态学差异,对建议的新种的界定也做了详细的描述。