坎利酮(canrenone)是一种激素类甾体药物,在临床中可以用于水肿、心衰、高血压等心血管疾病的治疗,效果较为显著。但若用于治疗心脏病,可能存在一些危险后果如用药过量而导致死亡。另一种药物依普利酮(eplerenone)用于治疗心血管疾病时不良作用会明显减小,且可以通过关键医药中间体11α-羟基坎利酮来合成。11α-羟基坎利酮为坎利酮的羟基化产物。利用微生物转化法将坎利酮转化为11α-羟基坎利酮具有步骤简单、副产物少、条件温和等特点。本课题组已经完成了利用液态发酵方法转化坎利酮的研究。但液态发酵存在一些局限如:坎利酮为甾体化合物,其不溶于水的特性会在一定程度上影响转化,所以在液态发酵过程中往往要添加表面活性剂促进底物溶解,这使得后续的产物提取和纯化过程变得复杂,需要增加回收表面活性剂的步骤。同时,提取过程中需要使用与水互不相溶的有机溶剂乙酸乙酯进行萃取,乙酸乙酯具有低毒性,长期接触易侵害人体健康,对环境亦有不良影响。利用固态发酵则可以简化底物转化及产物提取过程,且环境友好。因此,本课题利用根霉菌(Rhizopus sp.UJS-0602)固态发酵转化坎利酮生成其羟基化产物11α-羟基坎利酮,优化了转化培养基的成分;考察了转化过程中根霉菌体生物量、产物和底物含量的变化,建立了发酵动力学模型;选定了产物的提取条件并进行了优化,产物纯化后通过对比底物及产物的谱图,进一步确定产物为11α-羟基坎利酮,并对发酵后剩余的基质残渣进行了综合利用的探索。主要结论如下:(1)利用根霉(Rhizopus sp.UJS-0602)通过固态发酵转化坎利酮,以坎利酮的转化率为单因素实验指标研究培养基组成:碳源、氮源、无机盐、营养因子、水分含量和底物添加量对转化率的影响。结果表明:葡萄糖、硫酸铵和甘氨酸分别为最佳碳源、氮源和营养因子种类,无机盐的添加会对转化过程产生抑制作用。葡萄糖、硫酸铵和甘氨酸的最佳添加量分别为1.0%,0.8%和0.8%,最佳料水比为1:1,最佳底物添加量为10%(m/m)。在单因素实验的基础上,以碳源、氮源添加量、营养因子添加量、料水比和底物添加量为关键因素,设计正交试验优化转化培养基组成,优化后的培养基条件为:葡萄糖1%,硫酸铵0.6%,甘氨酸0.8%,料水比为1:1,底物添加量为12%。经验证实验,在最佳培养基组成条件下,转化率可达到94.21%。(2)通过分析根霉菌的固态发酵代谢过程,确定产物合成的发酵类型属于生长部分偶联型,因此使用Logistic方程、Luedeking-Piret方程及物料衡算方程对菌体生长动力学、产物合成动力学以及底物坎利酮消耗动力学进行拟合建立模型。结果显示,根霉菌固态发酵动力学模型有良好的拟合效果。(3)通过设计正交试验确定了产物提取的最佳条件:采用乙醇冷凝回流的方式提取产物,优化后的最适提取条件为:提取剂乙醇浓度为80%(V/V),体积为100 mL,pH=2,提取温度为90℃,时间为5 h,次数为4次。在此条件下,提取率可达87.33%。提取后的产物经粗结晶、硅胶柱层析系统纯化并重结晶后得到产物纯品,纯度为97.28%。再进行产物鉴定:经高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)、傅里叶红外光谱(FT-IR)和核磁共振(NMR)检测后结果显示产物为11α-羟基坎利酮。发酵结束后对基质残渣的综合利用进行了初步探索,利用残渣发酵产生米酒并优化了发酵条件:最适发酵温度为28℃,发酵时间60 h,酒曲添加量2%,在此条件下米酒感官评分为84分,酒精度为3.5%vol。