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第一部分人脐静脉内皮细胞的Fractalkine表达以及阿司匹林干预的影响目的:探讨阿司匹林干预对肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)刺激的人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinousendothelial cell,HVVEC)表达fractalkine(FKN或CX3CL1)的影响及其机制。方法:将生长良好的人脐静脉内皮细胞随机分成以下8组(n=3):①空白组:HUVEC;②TNFα刺激组:HUVEC+TNFα;③NS-398干预组:HUVEC+NS-398(0.5μmol/L)+TNFα;④PDTC干预组:HUVEC+PDTC(40μmol/L)+TNFα;⑤⑥⑦⑧均为阿司匹林干预组,将分别予0.02mmol/L,0.2 mmol/L,1 mmol/L和5 mmol/L阿司匹林进行干预。除空白组和TNFα刺激组,其它6组HUVEC分别加入含上述浓度干预药物的RPMI1640培养基培养24小时,换液,空白组加入RPMI1640培养基,其它7组加入含4ng/ml TNFα的培养基再培养24小时。然后提取细胞总RNA,采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组细胞的FKN、环氧合酶(cyclooxygenase,COX)-1、COX-2和核因子kappaB(nuclear factor-kappaB,NF-kappaB)p65 mRNA表达;提取细胞膜蛋白、浆蛋白和核蛋白,采用蛋白印迹(western blot)法检测各组细胞的FKN、COX-1、COX-2和NF-kappaBp65蛋白表达。单因素方差分析各组HUVEC表达的FKN、COX-1、COX-2和NF-kappaB p65 mRNA相对灰度值以及FKN、COX-1、COX-2和NF-kappaB p65的蛋白相对灰度值。结果:1.RT-PCR显示各组HUVEC表达的FKN、COX-1、COX-2和NF-kappaB p65电泳条带有强度区别。单因素方差分析显示:①各组HUVEC表达的FKN mRNA差异有非常显著性意义(P＜0.001)。与空白组比较,4ng/ml TNFα使HUVEC的FKN mRNA明显增加(P＜0.001)。与TNFα刺激组比较,0.02mmol/L、0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L浓度阿司匹林干预组HUVEC的FKN mRNA水平下降(P＜0.05或P＜0.001),并且呈浓度依赖性。与TNFα刺激组比较,40μmol/L PDTC干预使HUVEC的FKN mRNA水平明显下降(P＜0.001),0.5μmol/L NS-398干预对FKN mRNA表达没有影响。②各组HUVEC表达的COX-1 mRNA差异有非常显著性意义(P＜0.001)。4ng/ml TNFα刺激后HUVEC的COX-1 mRNA表达无明显变化(P＞0.05),但是,与TNFα刺激组比较,0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L浓度的阿司匹林使HUVEC的COX-1 mRNA水平表达下降(P＜0.05),且呈浓度依赖性。0.02mmol/L阿司匹林、40μmol/L PDTC和0.5μmol/L NS-398干预对COX-1 mRNA表达没有影响。③各组HUVEC表达的COX-2 mRNA差异有非常显著性意义(P＜0.001)。与空白组比较,4ng/ml TNFα使HUVEC的COX-2 mRNA明显增加(P＜0.001)。与TNFα刺激组比较,0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L浓度的阿司匹林干预均使TNFα诱导的COX-2 mRNA水平下降(P＜0.05),并且呈浓度依赖性。0.02mmol/L阿司匹林、40μmol/L PDTC干预对TNFα刺激的COX-2 mRNA表达没有影响,而0.5μmol/LNS-398干预抑制TNFα刺激的COX-2 mRNA表达(P＜0.001)。④各组HUVEC表达的NF-kappaB p65 mRNA差异有非常显著性意义(P＜0.001)。空白组与4ng/ml TNFα刺激组的NF-kappaB p65 mRNA表达没有差异,0.02mmol/L、0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L浓度的阿司匹林干预均使HUVEC的NF-kappaB p65 mRNA水平下降(P＜0.05或P＜0.001),40μmol/L PDTC干预抑制NF-kappaB p65 mRNA表达(P＜0.001),而0.5μmol/L NS-398干预对NF-kappaB p65 mRNA表达没有影响。2.Western blot显示各组HUVEC表达的FKN、COX-2和NF-kappaB p65蛋白有强度区别。单因素分析显示:①各组HUVEC表达的FKN蛋白差异有非常显著性意义(P＜0.001)。与空白组比较,4ng/ml TNFα使HUVEC的FKN明显增加(P＜0.001)。与TNFα刺激组比较,0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L浓度的阿司匹林干预均使TNFα诱导的FKN蛋白水平下降(P＜0.01或P＜0.001),并且呈浓度依赖性。0.02mmol/L阿司匹林、0.5μmol/L NS-398干预对HUVEC的FKN蛋白表达没有影响。40μmol/L PDTC干预使HUVEC的FKN蛋白水平明显下降(P＜0.001)。②各组HUVEC表达的COX-1蛋白差异没有显著性意义(P＞0.05)。③各组HUVEC表达的COX-2蛋白差异有非常显著性意义(P＜0.001)。与空白组比较,4ng/ml TNFα使HUVEC的COX-2蛋白表达明显增加(P＜0.001)。与TNFα刺激组比较,0.02mmol/L、0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L浓度的阿司匹林干预使TNFα诱导的HUVEC的COX-2蛋白表达下降(P＜0.05或P＜0.001),并且呈浓度依赖性。0.5μmol/L NS-398和40μmol/L PDTC干预使COX-2蛋白表达明显下降(P＜0.001)。④各组HUVEC表达的NF-kappaB p65蛋白差异有非常显著性意义(P＜0.01)。空白组与4ng/ml TNFα刺激组的NF-kappaBp65蛋白表达没有差异,0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L浓度的阿司匹林干预均使HUVEC的NF-kappaBp65蛋白水平下降(P＜0.05或P＜0.01),40μmol/L PDTC干预抑制NF-kappaB p65蛋白表达(P＜0.001),而0.02mmol/L、0.5μmol/L NS-398干预对NF-kappaB p65蛋白表达没有影响。结论:①TNFα(4ng/ml)通过活化NF-kappaBp65诱导人脐静脉内皮细胞FKN mRNA以及蛋白表达增加。②阿司匹林浓度依赖性地抑制TNFα诱导的FKN mRNA和蛋白表达,这一效应可能与阿司匹林抑制COX-1活性、NF-kappaB p65活化以及NF-kappaB p65表达有关。③TNFα(4ng/ml)通过活化NF-kappaB p65诱导人脐静脉内皮细胞COX-2 mRNA以及蛋白表达增加。但是COX-2水平上调与TNFα诱导的FKN表达无关。阿司匹林浓度依赖性地抑制TNFα诱导的COX-2表达。第二部分ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块中fractalkine表达及阿司匹林的干预作用目的:探讨阿司匹林干预对高脂饮食喂养的ApoE基因敲除小鼠主动脉FKN表达的影响及其机制。方法:20只7周龄ApoE基因敲除雄性小鼠经普通饮食喂养观察1周后,随机分入以下3组:普通饮食喂养组(n=6):普通小鼠饲料,安慰剂灌胃;高脂饮食喂养组(n=7):高脂饮食,安慰剂灌胃;高脂饮食+阿司匹林干预组(n=7):在给与高脂饮食同时,予58mg/kg/d阿司匹林灌胃给药。试验12周后,处死动物,采血检测小鼠血清超敏C反应蛋白和血清总胆固醇水平。留取处理胸主动脉近心段,光镜下观察主动脉粥样硬化病理改变,病理图像分析软件观测动脉粥样斑块严重程度,应用免疫组化方法检测主动脉FKN、COX-1、COX-2、NF-kappaB p65组织表达。留取处理胸主动脉远心段,提取总RNA,采用RT-PCR法检测各组小鼠主动脉的FKN、COX-1、COX-2和NF-kappaB p65的mRNA表达。结果:1.实验前后各组小鼠体重比较无显著性差异。实验结束时,各组小鼠血清总胆固醇有显著性差异(P＜0.01),组间比较发现高脂喂养组血清总胆固醇较普食组明显增高(P＜0.01),而与阿司匹林组比较没有差异。各组间血清CRP比较没有显著性差异(P＞0.05)。直线相关分析显示,小鼠血清总胆固醇和C反应蛋白两者不相关(P＞0.05)。2.光镜下观察,普食组主动脉局部内膜下组织增厚,小灶粥样斑块形成。高脂组主动脉粥样斑块明显,管腔变窄。斑块内富含脂质,见大量泡沫细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞浸润,弹力板纤维增厚,部分内膜不完整,斑块呈脱落状。阿司匹林干预组见部分管壁有粥样斑块附着形成,但斑块面积、厚度、脂质含量以及巨噬细胞、平滑肌细胞浸润程度均较高脂组减轻。正常对照组血管壁无明显异常改变。3.病理图像分析各组小鼠主动脉的斑块面积与管腔面积比和斑块所占据的内膜周径百分数(PICAO)均有显著性差异(P＜0.05),而斑块最大厚度、斑块平均厚度之间的差异不明显(P＞0.05)。高脂组上述4项指标与普食组比较均有显著性差异(P＜0.05),而高脂组与阿司匹林组比较,仅斑块所占据的内膜周径百分数(PICAO)有显著性差异(P＜0.01)。4.免疫组化检测显示,各组小鼠主动脉粥样斑块处均有不同程度FKN、NF-kappaB p65、COX-2阳性染色,但以高脂组最明显。各组小鼠主动脉均可见COX-1阳性染色,三组的强度和分布无明显差异。5.单因素方差分析显示,各组小鼠主动脉FKN、COX-1、COX-2和NF-kappaB p65 mRNA表达均有差异(P＜0.001)。与高脂组比较,普食组和阿司匹林干预组主动脉FKN mRNA表达减弱,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.001)。与高脂组比较,普食组的COX-1 mRNA差异没有统计学意义,阿司匹林干预组的主动脉COX-1 mRNA表达明显减弱(P＜0.001)。与高脂组比较,普食组和阿司匹林干预组主动脉COX-2 mRNA表达减弱,差异有统计学意义(P＜0.001)。与高脂组比较,普食组和阿司匹林干预组主动脉NF-kappaB p65 mRNA表达减弱,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.001)。结论:①阿司匹林干预改善高脂饮食喂养的ApoE基因敲除小鼠主动脉粥样硬化病灶严重程度。这一效应可能与阿司匹林对NF-kappaBp65、COX-1、COX-2的抑制作用相关,而与血脂没有关联。②ApoE基因敲除小鼠主动脉有趋化因子fractalkine表达。阿司匹林干预下调高脂饮食喂养的ApoE基因敲除小鼠主动脉趋化因子fractalkine表达,这一效应可能与阿司匹林抑制NF-kappaB p65活化相关。③普食组小鼠血清总胆固醇和主动脉粥样硬化病变较高脂组明显减轻,提示饮食控制可延缓ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化进展。④ApoE基因敲除小鼠的血清C反应蛋白水平对于评价该模型动脉粥样硬化病变的意义不大。