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本研究建立了泌乳奶牛乳腺组织体外培养体系及奶牛乳腺组织αs-酪蛋白合成量的Western-blotting检测方法(试验一),并利用建立的体系和方法,分别研究了赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸浓度对αs-酪蛋白合成的影响(试验二)；蛋氨酸与蛋氨酸二肽不同组合对αs-酪蛋白合成的影响(试验三)以及不同氨基酸及二肽组合模式对αs-酪蛋白合成的影响(试验四)。
试验一、奶牛乳腺组织体外培养体系和αs-酪蛋白Western-blotting检测方法的建立。用贴壁培养法对乳腺组织进行培养,培养条件为:DMEM/F12培养液中含2μg/ml氢化可的松、5μg/ml转铁蛋白、10μg/ml胰岛素、5μg/ml泌乳素和10％胎牛血清。通过培养组织形态观察和MTT活性测定,发现奶牛乳腺组织在培养1d后开始贴壁,培养2d后组织块完全贴壁,且周围有成纤维细胞长出,说明培养的乳腺组织具有增殖活性。MTT值显示,4d后培养组织的活力达到稳定状态。
用牛αs-酪蛋白免疫新西兰兔,获得兔抗牛αs-酪蛋白多克隆抗体,经双向琼脂扩散检测其效价为1:16,并通过免疫印迹方法验证其为αs-酪蛋白特异抗体。比较了不同的转膜方法,发现湿转法更适合培养液中蛋白质的转膜。
试验二、培养体系中赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸浓度对αs-酪蛋白合成的影响。采用贴壁培养法培养奶牛乳腺组织,分别调整培养体系中赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苏氨酸(Thr)和苯丙氨酸(Phe)浓度,研究其对αs-酪蛋白合成的影响。基础培养液中Lys、Met、Thr、Phe、Val、Leu、Ile浓度均分别为120、60、103、105、154、214、120μg/ml,Lys浓度分别为120、145、170、195、220、245、270μg/ml,Met浓度分别为50、60、70、80、90、100、110μg/ml,Thr浓度分别为73、88、103、118、133、148、163μg/ml,Phe浓度分别为75、90、105、120、135、150、165μg/ml。结果显示,当Lys、Met、Thr和Phe浓度分别为195μg/ml、80─100μg/ml、118-133μg/ml和135-165μg/ml时,乳腺αs-酪蛋白合成量显著高于其他浓度组(P＜0.01)。通过拟合曲线估算αs-酪蛋白合成量最大时的Lys、Met、Thr和Phe的浓度分别为203、81、118和137μg/ml。
试验三、蛋氨酸及其二肽(Met-Met)不同组合对αs-酪蛋白合成的影响。试验共设5个组,各组的蛋氨酸浓度分别为50、67.5、85、102.5、120μg/ml,蛋氨酸二肽浓度分别为70、52.5、35、17.5、0μg/ml。试验结果表明,Met为85μg/ml、Met-Met为35μg/ml的组合(即中间组),其αs-酪蛋白合成量最高,且显著高于其他各组(P＜0.01)。通过拟合曲线计算Met浓度为81μg/ml、Met-Met浓度为38μg/ml,即Met与Met-Met的比例约为2:1时,αs-酪蛋白合成量最高。
试验四、不同氨基酸及二肽组合模式对αs-酪蛋白合成的影响。以乳蛋白氨基酸模式及根据Western-blotting法αs-酪蛋白基因表达所建立的不同氨基酸浓度组合为参照模式,设计3个模式,Lys:Met:Thr:Phe依次分别为100:34:56:63,100:40:58:68,100:54:62:64；在此基础上分别以Met-Met按量佳比例(Met:Met-Met为2:1)部分替代各模式中Met,设计二肽与氨基酸组合的3个模式,Lys:Met:Met-Met:Thr:Phe依次分别为100:22.5:11.5:56:63,100:26.5:13.5:58:68,100:34.5:17.5:62:64,以Lys浓度为200μg/ml调整各组的其他氨基酸浓度。试验结果表明,在以游离氨基酸进行配比的条件下,当Lys.Met:Thr:Phe为100:40:58:68时(即以Western-blotting法建立的氨基酸模式),其αs-酪蛋白的合成量最高。在以二肽部分替代游离氨基酸的条件下,当Lys.Met:Met-Met:Thr:Phe为100:22.5:11.5:56:63时αs-酪蛋白拘合成量最高,且高于完全以游离氨基酸配比时的αs-酪蛋白的合成量。
综上所述,贴壁培养法培养的乳腺组织在培养过程中能正常生长,可以用于体外培养研究,建立的Western-blotting方法可用于组织培养液中αs-酪蛋白的检则。奶牛乳腺组织利用Lys、Met、Thr和Phe均有一个最适浓度,在最适浓度下能显著促进αs-酪蛋白的合成。改变培养液中Met与Met-Met的比例能影响αs-酪蛋白的合成,当两者比例约为2:1时,αs-酪蛋白合成量最高。改变培养液中Lys:Met:Thr:Phe比例能影响αs-酪蛋白的合成,当此值为100:40:58:68时αs-酪蛋白的合成量最高；当Lys:Met:Met.Met:Thr:Phe为100:22.5:11.5:6:63时αs-酪蛋白的合成量最高,且高于完全以游离氨基酸配比时的αs-酪蛋白的合成量。
试验一、奶牛乳腺组织体外培养体系和αs-酪蛋白Western-blotting检测方法的建立。用贴壁培养法对乳腺组织进行培养,培养条件为:DMEM/F12培养液中含2μg/ml氢化可的松、5μg/ml转铁蛋白、10μg/ml胰岛素、5μg/ml泌乳素和10％胎牛血清。通过培养组织形态观察和MTT活性测定,发现奶牛乳腺组织在培养1d后开始贴壁,培养2d后组织块完全贴壁,且周围有成纤维细胞长出,说明培养的乳腺组织具有增殖活性。MTT值显示,4d后培养组织的活力达到稳定状态。
用牛αs-酪蛋白免疫新西兰兔,获得兔抗牛αs-酪蛋白多克隆抗体,经双向琼脂扩散检测其效价为1:16,并通过免疫印迹方法验证其为αs-酪蛋白特异抗体。比较了不同的转膜方法,发现湿转法更适合培养液中蛋白质的转膜。
试验二、培养体系中赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸浓度对αs-酪蛋白合成的影响。采用贴壁培养法培养奶牛乳腺组织,分别调整培养体系中赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苏氨酸(Thr)和苯丙氨酸(Phe)浓度,研究其对αs-酪蛋白合成的影响。基础培养液中Lys、Met、Thr、Phe、Val、Leu、Ile浓度均分别为120、60、103、105、154、214、120μg/ml,Lys浓度分别为120、145、170、195、220、245、270μg/ml,Met浓度分别为50、60、70、80、90、100、110μg/ml,Thr浓度分别为73、88、103、118、133、148、163μg/ml,Phe浓度分别为75、90、105、120、135、150、165μg/ml。结果显示,当Lys、Met、Thr和Phe浓度分别为195μg/ml、80─100μg/ml、118-133μg/ml和135-165μg/ml时,乳腺αs-酪蛋白合成量显著高于其他浓度组(P＜0.01)。通过拟合曲线估算αs-酪蛋白合成量最大时的Lys、Met、Thr和Phe的浓度分别为203、81、118和137μg/ml。
试验三、蛋氨酸及其二肽(Met-Met)不同组合对αs-酪蛋白合成的影响。试验共设5个组,各组的蛋氨酸浓度分别为50、67.5、85、102.5、120μg/ml,蛋氨酸二肽浓度分别为70、52.5、35、17.5、0μg/ml。试验结果表明,Met为85μg/ml、Met-Met为35μg/ml的组合(即中间组),其αs-酪蛋白合成量最高,且显著高于其他各组(P＜0.01)。通过拟合曲线计算Met浓度为81μg/ml、Met-Met浓度为38μg/ml,即Met与Met-Met的比例约为2:1时,αs-酪蛋白合成量最高。
试验四、不同氨基酸及二肽组合模式对αs-酪蛋白合成的影响。以乳蛋白氨基酸模式及根据Western-blotting法αs-酪蛋白基因表达所建立的不同氨基酸浓度组合为参照模式,设计3个模式,Lys:Met:Thr:Phe依次分别为100:34:56:63,100:40:58:68,100:54:62:64；在此基础上分别以Met-Met按量佳比例(Met:Met-Met为2:1)部分替代各模式中Met,设计二肽与氨基酸组合的3个模式,Lys:Met:Met-Met:Thr:Phe依次分别为100:22.5:11.5:56:63,100:26.5:13.5:58:68,100:34.5:17.5:62:64,以Lys浓度为200μg/ml调整各组的其他氨基酸浓度。试验结果表明,在以游离氨基酸进行配比的条件下,当Lys.Met:Thr:Phe为100:40:58:68时(即以Western-blotting法建立的氨基酸模式),其αs-酪蛋白的合成量最高。在以二肽部分替代游离氨基酸的条件下,当Lys.Met:Met-Met:Thr:Phe为100:22.5:11.5:56:63时αs-酪蛋白拘合成量最高,且高于完全以游离氨基酸配比时的αs-酪蛋白的合成量。
综上所述,贴壁培养法培养的乳腺组织在培养过程中能正常生长,可以用于体外培养研究,建立的Western-blotting方法可用于组织培养液中αs-酪蛋白的检则。奶牛乳腺组织利用Lys、Met、Thr和Phe均有一个最适浓度,在最适浓度下能显著促进αs-酪蛋白的合成。改变培养液中Met与Met-Met的比例能影响αs-酪蛋白的合成,当两者比例约为2:1时,αs-酪蛋白合成量最高。改变培养液中Lys:Met:Thr:Phe比例能影响αs-酪蛋白的合成,当此值为100:40:58:68时αs-酪蛋白的合成量最高；当Lys:Met:Met.Met:Thr:Phe为100:22.5:11.5:6:63时αs-酪蛋白的合成量最高,且高于完全以游离氨基酸配比时的αs-酪蛋白的合成量。