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在移植领域中,诱导一种持久稳定且无需药物的免疫耐受是迫切需要解决的问题。这些问题迄今尚未解决,也正是本研究试图回答的问题。器官移植术后,免疫耐受的诱导是一个多因素、多阶段的复杂过程,针对免疫排斥反应中的一些关键环节专门设计调节、阻断手段,可以达到抑制免疫排斥反应目的。尤其对于那些手术后免疫抑制剂药物的毒副作用严重患者,限制其进一步慢性移植物失功发生的措施是提高生存率和改善生存质量的关键。因此寻找一个能调控多个转移相关因素的关键分子和其相应的信号通路显得尤为重要。DAGs是T淋巴细胞活化的关键。但是当DAGs被甘油二酯酶(DGKs)作用后,T细胞不再对目标作出反应。因此,DGKs是设计抑制免疫排斥反应措施的理想靶点。如果能构建一种真核表达载体,转染到T细胞内,使T细胞高表达DGKs,将可能导致T细胞无反应性,诱导免疫耐受。
在本研究中,我们首先构建了大鼠DGK的真核表达质粒。我们将DGK蛋白克隆基因片断,插入到pcDNA3.1-(-)-C-3xflag和pcmv-3xflag-N的空载体中,成功的构建了可以高表达大鼠DGK蛋白的真核质粒。为研究DGK在体外细胞、体内肝移植模型上移植免疫排斥,打下实验基础。
T细胞通常情况下难以转染,因此我们研究了一种新型的非病毒载体,将T细胞特异性配体CD3单链抗体(scAbCD3)连接到载体PEG-PEI的PEG端(scAbCD3-PEG-PEI),可以有效地把基因传输到T细胞。这种聚合物首先与超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIONs)进行复合,然后将质粒DNA为聚集为具有理想的小尺寸和低毒性的纳米粒子。用报告基因对此进行检测,靶向性配体的连接在纳米载体上使鼠T淋巴细胞株HB8521细胞的基因转染水平提高了16倍,并用核磁共振成像扫描成功的监测了细胞靶向转输的过程。可见MRI对比剂的连接不影响基因的转输效率。通过这种纳米载体可以使T淋巴细胞高表达DGK蛋白。
令人鼓舞的是,将DGK转输到HB8521细胞中,可以对T细胞刺激增殖有43％的抑制效果,同时T细胞活化的重要功能细胞因子IL-2(白介素-2)的表达水平减少了38％。这表明通过基因治疗进行了有效的T细胞无能的诱导,显示了这种靶向性多聚物对T细胞不仅有高效率的基因转染而且具有低毒性,成功地应用体外,抑制T淋巴细胞的增殖和功能。
总之,在器官移植的免疫耐受中,DGK磁性纳米粒子的靶向基因传递可能是一个较为有效的治疗办法,在临床肝移植术后的综合治疗中具有巨大潜力。