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前言:喉癌是头颈部常见恶性肿瘤之一,约95%为鳞状细胞癌,主要起源于喉粘膜上皮组织,喉鳞状细胞癌具有较高的死亡率和预后不良。目前,喉癌的发生发展及预后的众多分子机制尚不完全清楚。因此,探究喉癌发生发展的分子机制,寻找其诊断及预后的生物分子标记物至关重要。miRNAs(microRNAs)是近年来发现的一类长度约为22个核苷酸的单链非编码RNA,通过特异性地结合靶基因mRNA的3’UTR而发挥作用。研究表明,mi RNA既可以作为癌基因下调抑癌基因的活性,也可以作为抑癌基因下调癌基因的活性。miR-200c是miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-429和miR-141)成员之一,位于12号染色体上。研究表明,miR-200c在多种类型的癌中对上皮-间充质细胞转化、细胞侵袭、转移、增殖、凋亡、自噬和抗治疗过程都起到决定性的作用,而且在不同肿瘤中发挥不同的作用。目前,miR-200c是否参与喉癌的发生和发展尚不明确。前期工作中,我们发现过表达PIN1加剧了中心体扩增、细胞异常分裂和细胞迁移。通过Targetscan等软件预测发现,PIN1是miR-200c的潜在靶基因之一。本研究中,我们将应用相关分子生物学技术探究miR-200c对喉癌Hep-2细胞生物学行为的影响以及miR-200c是否通过PIN1在喉癌中发挥其生物学功能。材料与方法一、实验材料(一)喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系。(二)组织标本:取自中国医科大学第一附属医院耳鼻喉科喉癌患者,全部病人术前未进行放化疗。标本保存于-80°C冰箱中,所有标本均经病理学检查确诊,并经医学伦理委员会批准及患者知情同意。(三)主要分子生物学相关试剂:RPMI1640培养基,Serana胎牛血清,RNAiso Plus RNA提取试剂,Takara定量试剂和RNA反转录试剂盒,SDS-PAGE凝胶试剂盒,兔抗PIN1单克隆抗体,鼠抗β-actin单克隆抗体,辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG,辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG,小鼠抗γ-Tubulin单克隆抗体,Dylight 488标记抗小鼠IgG,TIANGEN质粒提取试剂盒,FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I等。二、实验方法1、荧光素酶报告基因活性检测2、细胞培养3、基因瞬时转染实验4、qRT-PCR检测5、Western Blot检测6、CCK8检测7、Transwell小室检测法8、免疫荧光实验9、流式细胞术检测10、统计分析实验结果1、Real-time PCR结果显示,miR-200c在喉癌组织中的表达水平较癌旁组织增高(P<0.05),提示miR-200c参与喉癌的发生发展;此外,miR-200c在伴有淋巴结转移的喉癌组织中的表达水平显著降低(P<0.05),提示miR-200c可能在肿瘤转移过程中发挥作用。转染mi R-200c mimics和inhibitor后,Hep-2细胞中miR-200c的表达水平与对照组相比分别升高和降低(P<0.05),证明转染成功。2、CCK8检测结果显示,转染miR-200c mimics和mi R-200c inhibitor后,Hep-2细胞的生长速率无明显差异(P>0.05)。3、Transwell实验结果显示,miR-200c mimics转染组穿过小室的Hep-2细胞数显著低于对照组,而miR-200c inhibitor转染组中穿过小室的Hep-2细胞数多于对照组(P<0.05),提示miR-200c抑制Hep-2细胞的迁移。4、免疫荧光实验结果显示,miR-200c mimics转染组中心体异常扩增的细胞比例显著降低,miR-200c inhibitor转染组中心体异常扩增的细胞比例与对照组相比显著增加(P<0.05),提示miR-200c减弱细胞中心体的异常扩增。5、流式细胞术检测细胞凋亡实验结果显示,转染miR-200c mimics和miR-200c inhibitor后,Hep-2细胞的早期凋亡率无显著变化(P>0.05)。6、TargetScan等软件预测结果显示,在PIN1的3’UTR存在miR-200c的结合位点,提示PIN1是miR-200c的潜在靶基因之一。7、荧光素酶报告基因结果显示,共转染PIN1野生型报告载体和miR-200c mimics组荧光素酶活性与其他对照组相比显著降低(P<0.05),证实PIN1是miR-200c的靶基因。8、Real-time PCR和Western Blot结果显示,miR-200c mimics转染组中PIN1蛋白表达水平与对照组相比降低,miR-200c inhibitor转染组中PIN1蛋白表达水平较对照组增高(P<0.05),而相应的m RNA表达水平无显著差异(P>0.05),提示miR-200c在翻译水平抑制PIN1的表达。9、Real-time PCR结果显示,共转染PIN1和mi R-200c mimics,转染PIN1、mi R-200c mimics和mimics NC后,mi R-200c mimics转染组中mi R-200c的表达水平升高,PIN1转染组中PIN1的mRNA表达水平升高(P<0.05),提示转染成功。10、Western Blot结果显示,PIN1和mi R-200c mimics共转染组中PIN1的蛋白表达水平较PIN1组降低(P<0.05),进一步提示Hep-2细胞中miR-200c可在翻译水平抑制PIN1的表达。11、CCK8检测结果显示,共转染PIN1和miR-200c mimics后,与各对照组相比,Hep-2细胞的生长速率无明显差异(P>0.05)。12、Transwell实验结果显示,PIN1和mi R-200c mimics共转染组穿过小室的Hep-2细胞数较mimics组明显增多,较PIN1组显著减少(P<0.05),提示miR-200c调控PIN1抑制细胞的迁移。13、免疫荧光实验结果显示,PIN1和mi R-200c mimics共转染组与mimics组相比,中心体异常扩增的细胞比例显著升高,与PIN1组相比降低(P<0.05),提示miR-200c调控PIN1减弱细胞中心体的异常扩增。14、细胞凋亡实验结果表明,共转染PIN1和mi R-200c mimics后,与各对照组相比,Hep-2细胞的早期凋亡率无显著变化(P>0.05)。结论1、miR-200c参与喉癌的发生和发展。2、PIN1是miR-200c的靶基因之一。3、miR-200c通过调控PIN1抑制喉癌细胞的迁移能力和减弱中心体异常扩增。