基于“方证相关”理论剖析复杂方证关系是目前方剂学界面临的主要问题之一,而网络药理学为研究方证关系的现代内涵提供了新方法。中医学认为衰老与脾虚证关系密切,但目前脾虚与衰老关系的分子生物学研究几未有见,脾虚-衰老的分子机制尚不清楚。因此本研究基于方证相关理论,以补中益气汤与脾气虚证高度关联为逻辑依据,从衰老相立论,利用现代网络药理学方法探查补中益气汤分子药理网络;进一步根据该方的作用预测,在整体-系统-分子水平上,动态观察脾虚证模型演变过程中衰老相关病理生理及生物分子变化,以及补中益气汤的相关效用机制。论文分为文献综述和实验研究两部分。文献综述主要涉及近年“方证相关”的研究进展、脾虚证-衰老相关研究进展及补中益气汤现代研究进展三方面内容;实验研究主要包括脾虚证分子内涵与补中益气汤作用相关的网络药理学研究、脾虚证演变与衰老相关的探讨、以及从衰老探察脾虚证现代内涵及补中益气汤效用机制三部分。研究一脾虚证分子内涵与补中益气汤作用相关的网络药理学研究方法:利用TCMSP平台,分别检索补中益气汤组方药味(黄芪、白术、升麻、陈皮、柴胡、人参、甘草、当归、生姜、大枣)活性成分及其关联靶点,利用STRING平台建立靶点PPI网络并导入cytoscape,利用MCODE插件对PPI网络进行聚类来提取核心靶点簇后,使用ClueGO插件对核心靶点进行GO及KEGG富集,提取主要病/生理功能及生物分子信号通路。结果:①筛选得到补中益气汤活性成分143种,关联靶点162个,其中155个靶点之间存在PPI关系,聚类得到核心簇9个。②富集得到GO条目13组,包括NO生物合成、促进平滑肌细胞增殖等;富集得到KEGG条目12组,包括AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、松弛素信号通路等。结论:脾虚证-补中益气汤的关联机制内涵可能涉及由AGE-RAGE通路、IL-17通路及松弛素通路主导的,通过介导核转录因子NF-kB来调节促炎细胞因子分泌的炎性调节过程。研究二脾虚证演变与衰老相关的探讨方法:Wistar大鼠随机分为对照组与模型组,每组各18只。对照组常规饲养,模型组采用“游泳力竭+饥饱失常”法复制脾虚模型。各组大鼠:①隔日观察外观行为评分,每日称量摄食量,每周末观测体质量及粪便含水率。②于实验第2-4周末进行强迫负重游泳实验,测定负重游泳时长;实验第3、4周进行Morris水迷宫实验,测定定位航行实验逃避潜伏期和空间探索实验的游泳速度、潜伏期、平台穿梭次数、目标象限路程比及探索路线。③于实验第14、21、28d灌服D-木糖溶液后收集尿液,ELISA法测定尿D-木糖含量,计算D-木糖排泄率。于实验第15、22、29d随机分三批麻醉处杀:取脾脏、胸腺称重计算脏器指数;取血清,利用ELISA法测定GAS、MTL、AGEs、BDNF、VIP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平,利用生化法测定CRP水平;取海马,利用ELISA法测定AGEs、Aβ1-40、Aβ1-42、glu、GABA、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。结果:较之于对照组,模型组大鼠:①a.实验第2-4周皮肤毛发、行为状态、活跃程度、睡眠状态积分显著升高(P<0.01);第1-4周体质量、摄食量显著降低(P<0.01);第3、4周粪便含水率升高(P<0.05)。b.实验第4周负重游泳时间显著降低(P<0.01)。c.实验第4周脾脏指数与胸腺指数显著降低(P<0.01);第2-4周尿D-木糖排泄率显著降低(P<0.01),血清VIP水平降低;第3、4周血清GAS水平降低;第4周血清MTL水平降低(P<0.05或0.01)。②a.实验第3、4周空间探索潜伏期升高、穿越平台次数减少、目标象限路程比降低(P<0.05),探索路线呈随机策略。b.实验第2-4周海马GABA水平降低;第3、4周海马IL-1β水平显著升高;第4周海马Aβ140、血清BDNF水平降低(P<0.05 或 0.01),海马 AGEs、Aβ1-42/Aβ1-40、glu、IL-6、TNF-α 水平升高(P<0.05或0.01)。c.实验第2周血清IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05或0.01);第4周血清IL-1β、TNF-α水平显著降低(P<0.01)。结论:脾虚大鼠模型演化过程逐渐出现学习记忆能力下降的脑衰老表现,其分子特征体现为海马毒性蛋白累积、炎性水平升高与递质稳态兴奋性失衡。研究三从衰老探察脾虚证现代内涵及补中益气汤效用机制方法:Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量给药组与高剂量给药组,每组各8只。对照组常规饲养,模型组及各给药组按研究二方法持续造模4周,低、高剂量给药组自第15d至第28d起分别按5.85g/kg/d、17.55g/kg/d灌服补中益气汤水煎液。各组大鼠:①按研究二时间及方法观测外观行为评分、摄食量、体质量及粪便含水率。②按研究二方法,于实验第4周末进行强迫负重游泳实验;第4周进行Morris水迷宫实验。③实验第28d按研究二方法测定尿D-木糖排泄率。于实验第29d麻醉处杀后:取脾脏、胸腺计算脏器指数;取血清,ELISA法测定GAS、MTL、BDNF、VIP、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平;取海马,ELISA 法测定 AGEs、Aβ1-40、Aβ1-42、glu、GABA、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平,免疫组化法测定 p65NF-kB,Western-blot 测定 p65NF-kB、p-p65NF-kB、RAGE、Iba-1,免疫荧光双标法测定NeuN+cleavedcaspase-3、Iba-1+TNF-α、Iba-1+TGF-β1共表达;取下丘脑,免疫组化法测定p65 NF-kB,Western-blot测定p65 NF-kB、p-p65 NF-kB、Iba-1。结果:①较之于对照组,模型组大鼠:a.皮肤毛发、行为状态、活跃程度、睡眠状态积分升高(P<0.05或0.01),体质量、摄食量显著降低(P<0.01);粪便含水率升高(P<0.05)。b.负重游泳时间显著降低(P<0.01);尿D-木糖排泄率,血清GAS、MTL水平显著降低(P<0.01);血清VIP水平显著升高(P<0.01)。c.空间探索潜伏期显著增加(P<0.01),穿梭平台次数与目标象限路程比均降低(P<0.05),空间探索路线呈随机式策略。d.血清BDNF水平降低(P<0.05);海马AGEs、Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40、RAGE、glu、Iba-1、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平上升(P<0.05 或 0.01);p65NF-kB 表达量及活化程度上升(P<0.05或0.01),GABA、TGF-β1水平降低(P<0.05或0.01),NeuN 与 cleaved caspase3、Iba-1 与 TNF-α 共表达数增加(P<0.05 或 0.01)。e.下丘脑Iba-1表达量、p65NF-kB表达量及其活化程度显著上升(P<0.01),GnRH表达量显著降低(P<0.01)。f.脾脏及胸腺指数显著降低(P<0.01),血清IL-1β、TNF-α及TGF-β1水平显著降低(P<0.01)。②较之于模型组,各给药组大鼠:a.一般表征行为积分、体质量、摄食量、粪便含水率均有不同程度改善(P<0.05或0.01)。b.负重游泳时间显著增加(P<0.01);尿D-木糖排泄率,血清GAS、MTL水平均升高(P<0.05或0.01);血清VIP水平均显著降低(P<0.01)。c.空间探索潜伏期显著缩短(P<0.01),空间探索路线呈趋向式策略;高剂量组大鼠穿梭平台次数增加(P<0.05)。d.血清BDNF水平升高(P<0.05);海马NeuN与cleaved caspase3、Iba-1与TNF-α共表达数均降低(P<0.05),Iba-1与TGF-β1共表达数均增加(P<0.05或0.01);p65NF-kB表达量及活化程度均下调(P<0.05 或 0.01);AGEs、Aβ1-42、RAGE、glu、Iba-1、IL-1β 水平均降低(P<0.05或0.01),其中低剂量组大鼠海马IL-6与TNF-α水平显著降低(P<0.01);TGF-β1水平显著升高(P<0.01)。e.下丘脑Iba-1表达量、p65NF-kB表达量及其活化程度降低(P<0.05或0.01),GnRH表达量均升高(P<0.05)。f.高剂量组大鼠胸腺指数、血清IL-1β及TNF-α水平均升高(P<0.05或0.01);各给药组大鼠血清TGF-β1水平均升高(P<0.05 或 0.01),IL-6 水平显著降低(P<0.01)。结论:脾虚大鼠同时存在海马炎性衰老与外循环免疫衰老,AGEs/RAGE/NF-kB通路介导的小胶质细胞M1型激活与神经元凋亡可能是脾虚大鼠出现脑衰老表现的潜在机制。补中益气汤具有良好的健脾抗衰效用,其机制可能涉及抑制海马AGEs/RAGE/NF-kB信号通路过度激活及诱导小胶质细胞向M2型转化来保护神经元。本研究将方证相关理论与网络药理学分析手段相结合,以衰老为切入点,从整体-器官-细胞-分子层面系统探察了补中益气汤-脾虚证关联的机制,为探索中医方-证关联的生物学基础提供了新思路。