[目的]建立人-山羊嵌合体肝脏,观察人脐带间充质干细胞(hUCMSC)的生存和变化规律,为开展免疫耐受和肝脏疾病研究提供实验动物模型。[方法]1.hUCMSC的分离、鉴定:无菌条件下采集剖腹产男婴脐带,通过贴壁培养法分离细胞,采用镜检方法观察细胞形态特征、流式分析方法鉴定细胞免疫表型、体外诱导成脂、成骨、成软骨方法鉴定细胞分化潜能。2.hUCMSC的标记:采用携带绿色荧光蛋白基因(GFP)的慢病毒与hUCMSC共培养的方法转染标记hUCMSC,荧光显微镜检方法确认标记成功。3.胎肝内定位注射GFP标记的hUCMSC:在B超引导下进行胎羊肝脏内定位注射GFP标记的hUCMSC,羔羊出生后,通过手术方法切取部分肝脏组织用于植入细胞的鉴定分析:(1)GFP阳性细胞观察:切取羔羊少许肝脏制作冰冻切片,在荧光显微镜下观察肝脏组织中GFP阳性细胞的存在和分布;(2)SRY基因表达鉴定:采集新生羔羊少许肝脏组织,分别提取DNA进行PCR扩增以鉴定SRY基因的表达;(3)FISH鉴定分析:采集新生羔羊少许肝脏制作石蜡切片,采用SRY序列制作基因探针以进行原位杂交分析以证实植入细胞的存在。4.羔羊肝脏组织中人源细胞的功能鉴定:羔羊出生后,通过手术方法切取部分肝脏组织用于人源细胞的功能鉴定分析:(1)人肝细胞相关基因的RT-PCR检测分析:采集新生羔羊少许肝脏组织,分别提取总RNA后进行RT-PCR扩增以鉴定人肝细胞相关基因的表达;(2)人肝细胞相关蛋白的免疫组化染色分析:采集新生羔羊少许肝脏制作石蜡切片,运用免疫组化染色法检测人肝细胞相关蛋白的表达。(3)外周血人白蛋白(ALB)的检测;采集新生羔羊外周血,分离血清后采用人白蛋白ELISA试剂盒检测人ALB的含量。5.羔羊肝脏中人源细胞存活的长期观察;采集出生9个月的羔羊肝脏组织和外周血,再次进行GFP阳性细胞观察、FISH和免疫组化染色分析,并检测外周血ALB的含量。[结果]1.采用组织贴块法,使用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养液直接培养剪碎的男婴脐带组织,可以成功分离到呈旋涡状贴壁生长的成纤维细胞样细胞,流式细胞分析显示:这些细胞高表达CD29、CD90、CD105,不表达CD34。体外诱导分化实验证实:这些细胞分别在特定诱导培养条件下可以实现成脂、成软骨和成骨分化,可以判定为人脐带间充质干细胞(hUCMSC),传代至第5代即可获得足够数量的细胞用于实验研究。2.按照转染复数为100的剂量,将携带GFP的慢病毒转染液与hUCMSC共培养72h后,可以在荧光显微镜下观察到明亮的绿色荧光。3.在B超引导下,可以准确定位2-4月龄山羊胚胎的胎肝位置,准确穿刺并注射GFP标记的hUCMSC到胎羊肝脏实质区域,一次注射108的hUCMSC不会导致胎羊流产。4.人-山羊嵌合体肝脏的鉴定;(1)冰冻切片观察:出生1月的羔羊肝脏组织,荧光显微镜下可观察到注射过hUCMSC的肝脏组织中有绿色荧光分布,有的呈规则的管状结构,有的散在分布。没有接受细胞注射的阴性对照检测不到GFP阳性细胞的存在。(2)SRY基因表达鉴定:采用PCR方法可以在注射过男性hUCMSC的新生1个月羔羊肝脏组织中检测到人SRY基因的表达,包括雌性新生羔羊,而没有接受细胞注射的阴性对照羔羊检测不到人SRY基因的表达。(3)FISH分析鉴定:采用FISH方法可以在注射过男性hUCMSC的新生1个月羔羊肝脏组织中检测到人SRY基因的表达,包括雌性新生羔羊,而没有接受细胞注射的阴性对照羔羊检测不到人SRY基因的表达。5.羔羊肝脏组织中人源细胞的功能鉴定:(1)人肝细胞相关基因的表达:运用RT-PCR方法,可以在所有注射过男性hUCMSC的新生1个月的羔羊肝脏组织中检测到人肝细胞相关基因HNF4 α、HNF3 β和ALB基因的表达。没有接受细胞注射的阴性对照检测不到这些基因的表达。(2)人肝细胞相关蛋白的检测:运用免疫组化染色法,可以在所有注射过男性hUCMSC的新生1个月的羔羊肝脏组织中检测到人肝细胞相关蛋白HNF4 α和ALB的表达,HNF4α主要位于肝小叶中央经脉周围,ALB主要分布于中央静脉周围等肝小叶多个区域。没有接受细胞注射的阴性对照检测不到这些蛋白的表达。(3)外周血人白蛋白的测定:采用ELISA方法,可以在所有注射过男性hUCMSC的新生1个月的羔羊外周血中检测到人ALB(平均为49.8ng/ml)。6.嵌合体肝脏中人源细胞存活的长期观察:切取出生9个月的羔羊肝脏组织,荧光显微镜下依然可观察到注射过hUCMSC的冰冻切片肝脏组织中有绿色荧光分布,FISH分析证实SRY基因存在,免疫组化分析方法显示ALB和HNF4 α阳性,外周血中可以检测到人ALB(平均为4.5ng/mlng/ml)。[结论]1.采用组织贴块法、用10%FBS-DMEM/F12培养基,可以从男婴脐带分离扩增到呈漩涡状密集排列生长的hUCMSC,按照MOI值为100的剂量加入携带绿色荧光蛋白基因(GFP)的慢病毒共培养,可以成功标记hUCMSC;2.在超声引导下,可以实现2月龄的胎羊肝脏实质区内hUCMSC的定位注射,而且一次注射108个hUMMSC不会导致孕羊流产;3.胎肝内注射GFP标记的男性hUCMSC,可以形成人-山羊嵌合体肝脏。在出生1个月的羔羊肝脏组织中可以观察到GFP阳性细胞的存在或形成管状结构。经PCR和FISH分析证实一月龄的羔羊肝脏组织中存在人SRY基因的表达,RT-PCR和免疫组化分析显示在mRNA和蛋白水平有人肝细胞HNF4α和ALB的表达,前者主要位于肝小叶中央经脉周围,后者分布于肝小叶多个区域,并且可以在羔羊外周血中检测到人白蛋白的存在。这些植入的人源细胞及其人肝细胞相关蛋白的表达至少存在9个月的时间。表明成功建立了人-山羊嵌合体肝脏,hUCMSC分化为具有一定生物学功能的肝细胞。