论文部分内容阅读
玉米赤霉烯酮（ZEN）又称F-2毒素,由镰刀菌产生并普遍存在于发霉的小麦、玉米等谷物中。ZEN及其衍生物具有强烈毒性,人和动物食用被ZEN污染的农产品会导致器官、生殖系统、免疫系统疾病和雌激素综合征等,严重影响人畜健康;同时ZEN对农产品的污染也给世界各国带来巨大的经济损失。受ZEN污染较轻的谷物一般会作为饲料,用于动物的养殖,所以对牲畜的健康形成重大隐患。本研究旨在分离筛选ZEN厌氧降解菌,并研究其降解特性和降解机制,为厌氧环境下饲料中ZEN的降解脱毒提供新思路。研究主要取得以下成果:1)筛选获得ZEN厌氧降解菌,并对其进行系统鉴定:从新鲜猪粪中分离筛选出10株能够降解ZEN的厌氧菌株,其中F39在48 h内对5.0 mg/L ZEN的降解率达到87.36%,选择F39进行深入研究。F39在GAM平板上形成的单菌落,表面凹凸不平,边缘不整齐,呈花瓣形和假根状向外扩散,菌落不透明,呈白色至淡黄色,不宜挑起,有刺鼻气味,革兰氏染色阳性;电镜下菌体呈杆状,无鞭毛,能够产生孢子。PCR扩增并测定了F39的16S r DNA、rpo B基因序列,与NCBI中其它菌株的相关基因进行比对,结果显示与肉毒杆菌（Clostridium botulinum）和生孢梭菌（Clostridium sporogenes）的相似度高达99%;测定F39的全基因组序列,在其中没有比对到肉毒素产生的相关基因序列,证明F39不是肉毒杆菌。根据该菌株的16S r DNA、rpo B基因序列的系统发育地位分析及菌株形态观察和生理生化实验结果,F39最终被确定为生孢梭菌（Clostridium sporogenes）。2)研究ZEN厌氧降解菌F39的生长特性、对ZEN的降解特性和空气暴露的影响:分别测定了F39在不同培养时间、温度、初始p H和碳源条件下的生长情况,结果显示,在27℃-45℃、初始p H在7.0-11.0范围内F39均能较好生长,最佳生长温度为37℃,最佳初始p H为7.0,最适利用碳源为牛肉膏。不同条件（培养时间、温度、初始p H、培养基、ZEN浓度）下测定了F39对ZEN的降解效果,结果表明F39降解ZEN的最佳条件为:降解温度37℃,p H 7.0;在GAM培养基中降解效果最佳;ZEN浓度在1.0-15.0 mg/L范围内均可被有效降解,在低浓度1.0 mg/L下相对降解速度较快,在高浓度15.0 mg/L条件下,相对降解速度较慢,但ZEN减少的绝对量最高。空气暴露对F39有一定影响:该菌不能在有氧环境下生长,但有一定耐氧性,短时间（0-3 d）暴露于空气后,再转移到厌氧环境中仍能继续生长;短时间（1 d）空气暴露对F39的微观形态无显著影响。3)确定了F39中ZEN降解活性物质的存在部位,研究了空气暴露对F39降解活性物质的影响;分离鉴定了ZEN降解产物,评价了F39对ZEN的脱毒效果:通过测定F39的上清液和细胞破碎液对ZEN的降解效果,明确了F39的降解活性物质主要位于细胞内,细胞破碎液能在6 h内降解77.30%的ZEN（5 mg/L）;F39细胞破碎液经沸水浴处理20 min后,对ZEN不再具有降解作用,推测F39的降解活性物质为酶类;使用在空气中暴露1 d的F39细胞破碎液降解5 mg/L ZEN,6 h仅能降解20.69%,说明该菌的降解活性物质不能在有氧条件下有效地保持降解活性。F39降解ZEN过程中,将大部分ZEN彻底降解,生成了极少量的α-玉米赤霉烯醇（α-ZEL）和β-玉米赤霉烯醇（β-ZEL）;把F39降解ZEN的产物进行毒性评价,结果显示,ZEN降解产物对人肝癌细胞Hep G2的毒性与ZEN相比显著降低,对人乳腺癌细胞MCF-7无显著雌激素效应,因此ZEN通过F39的降解达到脱毒效果。4)研究了ZEN降解菌F39对不同饲料中ZEN的降解效果,明确了降解影响因素:选择了6种不同的饲料原料,测定了F39对不同饲料中ZEN的降解效果,结果显示:F39对小麦粉中的ZEN具有较好的降解效果,对5 mg/L ZEN降解率可达48.65%。F39对六种饲料原料中ZEN的降解率均低于对GAM培养基中ZEN的降解率,通过调节饲料的p H至F39最适降解p H 7.0,可将A饲料中ZEN的降解率从25.39%提升至43.21%,由此可知饲料p H对ZEN降解率有显著影响。另外测定了降解时间和饲料中ZEN浓度对降解率的影响,结果显示,F39在饲料中作用4 d后,ZEN降解率保持稳定;ZEN浓度在0.5-5.0 mg/L范围内,对ZEN降解率的影响无显著差异。