雄烯二酮（AD）是甾体药物合成的核心中间体。在微生物发酵降解植物甾醇侧链生产AD过程中,存在辅因子代谢失衡、电子传递效率低与丙酮酸积累的毒害作用等问题,导致菌体转化周期长、生产强度下降。由于甾醇代谢途径的复杂性以及对甾醇代谢途径的认识不足,目前提高植物甾醇生产菌株生产力的方法多是针对代谢途径中的关键酶基因的修饰,往往集中在单酶和少数酶功能的增强或减弱上,忽略了对整体代谢通路的调控,常常引起生产强度的下降或副产物的产生。本文以AD优良生产菌株新金分枝杆菌Mycolicibacterium neoaurum TCCC 11978（MNR M3）为研究对象,将转化周期过长和生产强度低的现实问题集中在菌株的电子传递链和副产物丙酮酸的代谢的调控上,建立基于电子传递与丙酮酸代谢的协同调控策略。在此基础上,综合代谢工程和发酵工程等技术,增强菌株生产强度和产物的生成率,为AD生产菌株构建提供新的思路,本文取得研究结果如下。通过生物信息学分析,找到了甾醇代谢途径中,电子传递链两条途径NADH呼吸链与FADH2呼吸链的关键酶。通过分别加强NADH脱氢酶和SDHX琥珀酸脱氢酶,对菌体生长及植物甾醇生物转化的影响进行对比分析。单过表达NADH脱氢酶和SDHX（琥珀酸脱氢酶）后,复合体Ⅰ和复合体Ⅱ的表达水平有所上调。复合体Ⅰ相关的（poxA）NADH脱氢酶过表达使得复合体Ⅰ的酶活提高了1.53倍,AD的摩尔转化率提高了27.39%,植物甾醇的转化率为91.06%。复合体Ⅱ相关的SDH脱氢酶中,过表达sdh B亚基使得最终复合体Ⅱ的酶活提高了1.13倍,AD的摩尔转化率提高了24.42%,最终植物甾醇的转化率为88.09%。研究发现甾醇代谢与电子传递链代谢途径存在关联性,加强电子传递链途径关键酶有利于分枝杆菌MNR M3的植物甾醇生物转化,其中影响更显著的为复合体Ⅰ所在的呼吸链。基于生物信息学分析,找到了甾醇代谢途径中丙酮酸降解的关键酶,分析了poxB（丙酮酸脱氢酶）的过表达对甾醇代谢的影响。单过表达poxB后,其丙酮酸含量为原始菌株的76.03%,并且使AD的产量提高了28.49%,最终植物甾醇的转化率为92.16%。推测强化丙酮酸脱氢酶基因可以减少胞内丙酮酸的积累并增强糖酵解途径的效率。构建了poxA和poxB串联表达菌株,同时加强poxA和poxB使乙酰辅酶A的含量较原始菌增加了1.38倍,转化率提高了33.39%,生产周期缩短了两天。对串联表达菌株进行了发酵条件优化,植物甾醇与环糊精1:2,接种量为10%是最优发酵条件,使用静息细胞转化使得10g/L时AD的产量提高了26.34%,AD的终浓度为5.64g/L。本研究为雄烯二酮生产提供了一种高效、经济的生产策略。