刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种呈世界性分布的专性细胞内寄生原虫，可寄生在除红细胞外的所有有核细胞中，引起人兽共患的弓形虫病。弓形虫是一种重要的机会性致病原虫，免疫功能受损或缺陷者感染后，如肿瘤病人，AIDS患者等，可引起全身播散性损害，严重者可导致死亡。妊娠期感染弓形虫可通过胎盘垂直传播，引起早产、流产、死胎或婴儿发育畸形等。近年来，由于艾滋病的广泛流行和宠物饲养的逐渐增多，弓形虫的危害也日益突出，弓形虫感染成为一个日益严重的公共卫生问题，但是至今仍无治疗弓形虫病安全有效的药物，深入了解其致病机制对于弓形虫病的防治具有重要的意义。 入侵宿主细胞、逃避宿主免疫防御是弓形虫致病的首要条件，弓形虫表膜蛋白中的SRS(SAG1-related sequence)蛋白家族在其中起了重要的作用。已有的研究结果显示，SRS蛋白超家族可能为弓形虫入侵多种受体细胞提供了丰富的受体表位，介导弓形虫对宿主细胞的识别、粘附和入侵。弓形虫可能利用SRS表面抗原的差异性表达来逃避宿主免疫清除，维持持续感染。有些SRS蛋白家族成员的表达还可能直接影响弓形虫的毒力。由于技术方法的限制，目前研究最多的SRS蛋白家族成员是SAG1,对其他的SRS蛋白家族成员的结构和功能研究较少。近年来，RNAi技术的发展以及重组蛋白体外表达技术的成熟，为深入研究基因的功能提供了切实可行的方法和手段。 SAG3是SRS蛋白超家族的重要成员之一。其与SAG1具有相似的三级结构且均可介导弓形虫与宿主细胞的粘附。但与SAG1不同的是，其在弓形虫速殖子与缓殖子期均有表达，且具有较低的免疫原性。但是SAG3在弓形虫致病机制中的地位和作用目前知之甚少，为了深入研究SAG3的功能，本研究建立了弓形虫SAG3基因RNAi以及原核表达体系，希望为进一步研究基因的功能以及分析功能结构域奠定基础。 研究目的:建立弓形虫SAG3基因RNAi以及原核表达体系，为近一步研究SAG3的结构与功能奠定基础。 研究方法: 1）SAG3 RNAi体系的建立：以弓形虫SAG3基因3’-UTR区及CDS区为靶目标体外转录合成dsRNAs，通过电转法化将其分别导入弓形虫速殖子体内，用转染后的弓形虫感染 SMMC7721细胞，显微镜下观察虫体形态学上的改变并利用半定量RT-PCR对RNAi效果进行分析鉴定。 2）pET30-SAG3原核表达体系的建立：从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出SAG3基因编码序列，克隆入原核表达载体pET-30a(+)中，序列测定正确后，转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达。利用SDS-PAGE和Western Blot对表达产物进行鉴定。 研究结果 1）建立了通过电转化构建转基因弓形虫的方法，筛选出了可以有效抑制弓形虫SAG3基因的dsRNA序列，初步确定了弓形虫中RNAi发生及持续时间：转染12h后，显微镜下观察虫体形态学改变检测干扰效果，可见干扰组细胞外的弓形虫数明显少于空白对照组和阴性对照组。分别于转染12h、24h、48h后，RT-PCR检测SAG3基因 mRNA，检测干扰效果。结果显示dsRNA转染组，SAG3 mRNA水平明显低于未转染dsRNA的空白对照组和阴性对照组。其中以电压0.4kv，时间延迟为9ms的3’UTR dsRNA转染组效果最好。转染12h后，即有较明显的干扰效果。转染24h后，干扰效果最为显著，转染后48h的干扰效果不如12h和24h好。作为内参照的β微管蛋白的mRNA表达量的改变与其同组目的基因mRNA表达量变化趋势相一致。 2）构建了pET30-SAG3原核表达质粒，经测序证明，其与GenBank中所给出的序列号为AF340227的基因序列完全吻合，IPTG诱导表达后，SDS-PAGE凝胶电泳得到一约43kDa的融合蛋白，经western blot鉴定其可与6xHis抗体相结合。 结论 1）初步建立了有效的SAG3基因表达干扰体系，为深入研究SAG3基因的功能及开展弓形虫功能基因组学研究奠定基础。 2）成功构建了pET30a-SAG3原核表达体系，为体外分析SAG3基因的结构功能域奠定了基础。