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第一章：两个Waardenburg综合征Ⅳ型家系的临床特征及相关基因突变研究目的：收集了两个Waardenburg综合征Ⅳ型家系（WSO1家系和WS02家系）,拟对其进行临床诊断分析和基因突变检测研究。方法：对两个家系成员进行了病史采集、临床听力学分析及体格检查,并进行了Waardenburg综合征Ⅳ型相关基因（EDNRB.EDN3.SOX10基因）的外显子测序以筛查致病突变。结果：WS01家系一共两代5人,先证者与其大姐分别为Waardenburg综合征Ⅳ型和Waardenburg综合征Ⅱ型患者,两位患者均表现为左眼虹膜异色,先证者伴有先天性巨结肠；WS02家系先证者为1岁女童,Waardenburg综合征Ⅳ型患者,双侧虹膜异色,伴有先天性巨结肠。三位患者听力学检查均提示双耳极重度感音神经性聋,眼底检查呈现晚霞状改变,无皮肤毛发颜色异常及内眦移位。WSOl家系的先证者及其大姐均检测到有SOX10基因的2号外显子上存在c.254G>A （P. Trp85X）杂合突变,而先证者的母亲（正常人）SOX10基因的2号外显子上也检测到有c.254G>A杂合突变,多次测序后发现突变峰的高度仅为正常峰高度的1/3；WS02家系的先证者SOX10基因的4号外显子测序发现一个剪接位点的杂合突变c.698-2A>T,患者的父母未携带此突变。用直接测序法对100例不相关的正常人进行SOX10基因突变c.254G>A和c.698-2A>T的检测,结果没有检测到相同突变。结论：1.本研究所报道的Waardenburg综合征Ⅳ型病例属国内首次报道；2.SOX10基因突变位点c.254G>A（P. Trp85X）和c.698-2A>T属于新发突变位点,目前国内外尚无此突变位点的报道；3.SOX10基因可能存在镶嵌体。第二章：一个常染色体显性遗传性耳聋大家系的致病位点定位研究目的：为明确一来自湖南张家界地区非综合征型常染色体显性遗传耳聋家系的基因诊断,对此家系进行了初步的定位及候选基因筛查工作方法：收集了一4代人的常染色体显性遗传非综合征型耳聋家系,家系中一共有41人,由于家系发病年龄在20-30岁左右,故将未到达发病年龄的家系成员排除在研究外。本研究共对家系中14名成员（其中包括7名患者和7名正常人）进行了临床诊断分析、遗传基因定位及基因筛查研究。首先,根据家系耳聋患者的临床表型及遗传方式,对家系成员进行了最常见的非综合征型显性耳聋基因COCH、EYA4、GJB2、GJB3基因的直接测序排查及与家系表型相似的耳聋致病位点的排除定位分析。排除分析后应用Illumina linkage芯片对该家系进行了全基因组扫描以初步定位致病区间,在初步定位的区间内挑选MARKER进行精细定位。最后,对精细定位区间内的已知耳聋基因进行直接测序筛查家系致病突变。结果：家系临床特征表现为：语后聋,20-30岁左右发病,发病初期表现为耳鸣及高频听力下降,40岁左右进行性发展为双耳重至极重度聋。排除COCH、EYA4、GJB2、GJB3基因及相关耳聋致病位点后进行了全基因组扫描及微卫星精细定位,经过多点Lod值的计算及单体型分析最终将该家系的致病区间定位在chr1:P34.2-P34.3 （D1S2656;D1S3721）约8.21cM的区间,在D1S2729和D1S2892marker得到了最大多点lod值3.1,此区间与已定位的DFNA2位点重叠,对DFNA2位点上两个己克隆耳聋基因GJB3和KCNQ4进行直接测序筛查后未发现与家系相关的致病突变。结论：DFNA2位点上可能存在其他的基因参与该家系耳聋的发生。第三章：Illumina Goldengate 384k高通量耳聋基因筛查芯片的设计、研发及其对遗传性耳聋家系的检测目的：设计、制备Illumina Goldengate 384K高通量耳聋基因筛查芯片,采用此芯片以期在更广的范围内对已知耳聋突变位点进行筛查和对耳聋大家系进行己定位耳聋位点的排除定位。方法：芯片设计原则：由于芯片的引物探针需间隔60bp以上才能确保准确的杂交,故我们在找出所有己知耳聋相关突变位点的基础上,首先挑选出目前文献报道有2篇以上的突变位点,再依据60bp距离尽可能多的将剩余的突变位点设计在芯片上,一共选取了240个耳聋相关突变位点,包括77个显性突变位点及163个隐性突变位点。另外,我们在亚洲人群中报道的己克隆耳聋相关基因中,选取了144个SNP位点,整张芯片共384个检测点。该芯片可进行已知耳聋相关突变位点的高通量筛查和耳聋相关家系的初步排除定位。我们通过对465例DNA样本进行Illumina GoldenGate 384K高通量耳聋基因芯片筛查,统计芯片Call rate、对其准确性进行了验证、对芯片中144个SNP位点的等位基因频率进行了统计分析及对芯片的排除定位连锁分析进行了验证。对90个耳聋家系的135例DNA样本的芯片检测结果进行分析。结果：1.芯片总的Call rate为96.32%,Call rate达到100%的位点有110个；2.对芯片上的GJB2235delC突变检测点进行了准确性验证后发现芯片此检测点的假阳性率为3/97（3.1%）,假阴性率为0；3.芯片中有8个基因的19个SNP位点的最小等位基因频率小于0.1（10%）；4.芯片对本研究中一耳聋家系的定位位置与传统的微卫星定位扫描定位的位置相同,认为该芯片能较准确的进行耳聋相关基因的排除定位连锁分析；5.在此次患者样本检测中共有12个基因的31个突变检测位点在耳聋家系患者中有检出,剩余有189个检测位点在此次检测中无检出。这189个耳聋突变位点在中国耳聋家系人群中则可能属于罕见的突变位点。对90个耳聋家系的135例DNA样本的芯片检测结果进行分析后发现GJB2235delC、SLC26A4IVS7-2A>G等突变位点与目前国内报道的突变检出率相似,PJVK988delG （57.36%）、SLC26A4Gly497Ser （7.14%）等既往报道中的非热点突变在此次耳聋家系患者中也具有很高的突变检出率。结论：研究所设计的高通量耳聋基因筛查芯片可以更广范围内对一些不常检测的耳聋相关突变位点进行检测及可对耳聋家系进行初步排除定位。PJVK988delG （57.36%）、SLC26A4Gly497Ser （7.14%）等既往报道中的非热点突变在耳聋家系患者中具有很高的突变检出率,其是否是多肽或是与检测人群不同有关还是芯片检测的准确性问题?我们将在下一步工作中对有检出的突变位点进行准确性验证,并对芯片设计内容进行调整,剔除突变频率较低、Call rate及准确性低的耳聋相关突变位点,加入由于突变位点引物设计要求60bp间距而在此次设计中未加入芯片的耳聋相关突变位点,剔除最小等位基因频率<10%的SNP位点,并选择同一位置的其他SNP位点进行替换,进一步完善芯片。