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乳酸菌在食品加工、活性功能以及安全性等方面具有的优势,使其广泛用于食品、医药等行业。而乳酸菌在发酵过程中产酸、作为益生菌进入人体后,均会受到酸胁迫,影响菌株自身的生存、增殖及其活性功能的发挥。白酒作为中国的传统蒸馏酒,在酿造过程中,乳杆菌逐步占据绝对优势。酿造体系中富含乳酸、乙酸等有机酸,乳杆菌耐受酸胁迫的能力强可能是其占据主导的原因。虽然乳杆菌具有多种抵抗酸胁迫的机制,如F0-F1-ATPase质子泵、谷氨酸脱羧酶(GAD)系统、碱产生途径等。其中GAD系统是乳杆菌抵抗酸胁迫最重要的机制之一。另外,GAD系统发挥耐酸作用时产生的γ-氨基丁酸(GABA)产物具有多种生理活性,在食品、医药、化工等领域得到广泛应用。虽然目前已确定乳杆菌GAD系统的功能,但乳杆菌GAD系统的调控机制尚不清楚。因此,本论文基于筛选白酒酿造体系中具有GAD系统的耐酸的乳杆菌,深入解析其耐酸作用及其调控机制,同时提高产物GABA的产量,主要研究结果如下:(1)当谷氨酸存在时,短乳杆菌标准菌株ATCC367的酸耐受性与其GABA合成具有显著相关性,因此,为了获得以GAD系统介导的耐酸的乳杆菌,建立了以GABA的产量为判定标准的筛选方法。采用白酒酿造体系的酸性发酵酒醅为筛选资源,筛选获得66株GABA产生菌,其中19株菌的GABA合成能力大于1.0 g/L。这19株菌中,主要以短乳杆菌为主(11株)。其中具有高耐酸能力的短乳杆菌D17,通过控pH、分批补谷氨酸钠与流加补葡萄糖的混合补料发酵策略,GABA产量达到177.7 g/L,生产效率为4.94 g/L/h。(2)研究表明乳酸乳球菌的GAD系统编码基因gadC(编码谷氨酸/GABA反转运蛋白)与gadB(编码GAD)的转录受转录调控子GadR(gadR编码)的调控,针对乳杆菌中也存在一个被注释为GadR的蛋白,但该蛋白是否是真正的调控子,且是否参与调控乳杆菌的GAD系统尚不清晰。通过对短乳杆菌的注释基因gadR进行同框缺失,确定了GadR对乳杆菌GAD系统的调控机制。结果表明:在短乳杆菌中,该注释基因编码的GadR是GAD系统的调控子,它通过正调控gadB与gadC的转录,介导调控短乳杆菌的GABA合成及谷氨酸依赖的酸耐受性。ΔgadR菌完全不产GABA,且对酸敏感。当谷氨酸存在时,酸刺激0.5 h,短乳杆菌野生菌的细胞存活能力高于ΔgadR菌391倍,说明短乳杆菌谷氨酸依赖的耐酸系统是其主要的耐酸系统。同时解析了短乳杆菌D17高耐酸及高产GABA的原因是由于gadR高表达造成的。GadR可作为靶标基因,为提高含有gadR的乳酸菌的GABA合成与耐酸能力提供一种新的改造策略。(3)为了深入解析乳杆菌GAD系统的调控机制,发现在革兰氏阳性菌中普遍存在的氮代谢调控子GlnR,对短乳杆菌的GAD系统具有调控作用。结果表明:在短乳杆菌中,普遍存在的调控子GlnR负调控菌株的GABA合成能力。标准菌株ATCC367ΔglnR菌的GABA累积浓度达17.9 g/L,比野生菌(10.6 g/L)高69%;高耐酸短乳杆菌D17ΔglnR菌的GABA合成效率提高1倍。GlnR抑制短乳杆菌谷氨酸依赖的耐酸系统。谷氨酸存在时,ΔglnR菌的耐酸能力均显著高于其野生菌,而谷氨酸不存在时,野生菌与ΔglnR菌均对酸敏感。GlnR不仅抑制谷氨酰胺合成酶的编码基因glnA的转录,也通过抑制gadR,gadC与gadB的转录,与GadR级联调控gadCB操纵子的转录,从而介导调控短乳杆菌的GABA合成与谷氨酸依赖的酸耐受性。GlnR对GAD系统的调控是通过直接结合在gadR与gadCB操纵子的5’-非编码区控制gadR与gadCB操纵子的转录实现的,结合序列分别为TTTACCGCGCACACTTAGAGAAAGGCCAGTTAACTAGA与TTAATTGACACCGCTTCGTTTGGTTGTG。通过控pH、分批补谷氨酸钠与流加补葡萄糖的混合补料发酵策略,ATCC367ΔglnR菌的GABA产量达284.7g/L,高于野生菌9.8倍;高耐酸短乳杆菌D17ΔglnR菌的GABA产量达301.5 g/L,高于野生菌69.7%。(4)基于转录组测序,解析了GlnR对短乳杆菌的多效调控作用。结果表明,谷氨酸钠的添加可拉动短乳杆菌的代谢能力,但对GlnR的调控作用无影响。在短乳杆菌中,GlnR直接激活阿拉伯糖转运基因的转录;抑制阿拉伯糖的利用、木糖的转运与木糖利用相关基因的转录;间接抑制或参与其他糖转运、己糖的磷酸化以及激活核糖的磷酸化的基因的转录。通过对木糖与阿拉伯糖利用的发酵验证,证实GlnR直接抑制木糖与阿拉伯糖的利用,其是一种新型的调控非速效碳源代谢的机制。GlnR直接激活氮源代谢与氨基酸转运的相关基因转录,特别是arcC、oppA与RS19580的转录,可能间接参与调控其他氮源代谢与氨基酸转运的相关基因转录。GlnR直接抑制脂肪酸合成相关基因的转录,直接激活辅酶代谢相关基因如ribH与rihD的转录,可能间接激活其他辅酶代谢的相关基因转录。在短乳杆菌中,GlnR是具有多效调控功能的调控子。(5)为了扩展高耐酸短乳杆菌的应用,通过基因工程技术,改造高耐酸短乳杆菌D17用于消减白酒酿造体系中的异嗅味物质4-甲基苯酚。结果表明:首先建立了白酒酿造体系中短乳杆菌的生长情况的检测方法,即以混菌的DNA为模板,通过荧光定量PCR测定短乳杆菌特有的cps基因的相对丰度。将谷氨酸棒杆菌的4-甲基苯酚降解途径中的关键酶4-甲基苯基磷酸酯合成酶在短乳杆菌中实现过表达,通过磷酸酯化异嗅物质4-甲基苯酚,提高产物沸点,实现4-甲基苯酚在白酒酿造体系中的消减。4-甲基苯基磷酸酯合成酶过表达菌株在模拟白酒酿造体系能有效消减4-甲基苯酚,消减量为530μg/kg,消减率达37.9%。