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鸡卵黄免疫球蛋白,简称Ig Y(chicken egg yolk immunoglobulin)。由于Ig Y原料易得、制备简单、不与类风湿因子以及哺乳动物的补体发生交叉反应,应用十分广泛。目前Ig Y的分离纯化方法复杂且耗时长,性质不稳定,易受温度、p H值、酶的影响。Ig Y免疫球蛋白的糖链在维持其理化性质、抗原特性等功能中扮演着重要角色,对Ig Y进行糖基化修饰不仅可以维持空间构象、稳定糖蛋白结构、保护其免受某些蛋白酶裂解等方面有重要作用,而且还能改变某些生物活性和抗原特性。因此对Ig Y蛋白质进行糖基化修饰,具有十分重要的意义。本论文通过建立一种高效、简便的分离纯化的方法,制备了不同种类单糖与聚糖糖基化Ig Y,比较糖基化修饰前后Ig Y的结构与功能性的关系。研究结果如下:1.建立了一种适用于工业化生产高效、低成本的Ig Y提取方法。选用五种多糖(果胶、卡拉胶、羧甲基纤维素、甲基纤维素、硫酸葡聚糖)和五种浓度(0.01%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%)配制的去脂液,比较了其对Ig Y分离效果的影响,通过SDS-PAGE、Western blots以及HPLC对Ig Y的提取量、纯度进行分析。果胶、硫酸葡聚糖、卡拉胶、羧甲基纤维素均在0.1%浓度时对Ig Y分离效果最好,提取量可分别达到8.36 mg/m L、9.31 mg/m L、7.64 mg/m L和8.1 mg/m L,纯度分别达83.3%、80.1%、80.94%和79.94%,而甲基纤维素在0.15%处对Ig Y分离效果最好,其提取量和纯度分别为7.65 mg/m L,78.17%。ELISA分析表明提取的Ig Y均保持较高的免疫活性。综合比较,由0.1%果胶配制的去脂液分离纯化Ig Y的效果最好,提取量8.36mg/m L,纯度83.3%。本方法能快速除去鸡卵黄中的脂蛋白,操作简单,适合工业化生产。2.选择了四种单糖(葡萄糖、果糖、岩藻糖、甘露糖)和不同糖链长度的葡聚糖(5000K、20000K、40000K、70000K),利用美拉德反应分别对Ig Y进行糖基化修饰改性,对其产物进行结构表征。紫外光谱和SDS-PAGE结果表明,单糖与聚糖糖基化修饰的Ig Y,褐变程度均随着糖基化时间的增加而增大。其中,四种单糖中果糖最易发生糖基化反应,葡聚糖糖链长度越短,越易发生糖基化。同时,利用红外、圆二光谱和荧光光谱监测了糖基化Ig Y蛋白质随糖基化时间的延长二级结构的变化。结果表明,随着反应时间的延长,糖基化修饰Ig Y产物的荧光强度下降,说明其分子周围疏水环境发生变化。CD光谱表明糖基化后Ig Y的α-螺旋程度升高,β-折叠下降。氨基酸分析显示糖基化后Ig Y赖氨酸和精氨酸的含量明显减少。3.对单糖与聚糖基化Ig Y产物的热稳定性进行了研究。DSC结果表明糖基化能明显改善Ig Y的热稳定性。天然Ig Y的热变性温度为70.4°C,葡萄糖糖基化Ig Y热变性温度在反应18 d达到最高(79.8°C),甘露糖糖基化Ig Y在24 d提高到最高(77°C),而果糖糖基化和岩藻糖糖基化Ig Y在12 d提高到最高,分别达到78.5°C和79°C。本文也比较了四种不同糖链长度的葡聚糖(5000K、20000K、40000K、70000K)糖基化对Ig Y热稳定性的影响。DSC结果表明,分子量5000聚糖修饰Ig Y产物的热变性温度在24 d达到最高(77.3°C),分子量20000聚糖修饰Ig Y产物在18 d达到最高值(75.9°C),分子量40000聚糖修饰Ig Y在18d提高最大(74.5°C),70000聚糖修饰Ig Y产物产物在12 d提高最大(74°C)。4.对单糖与聚糖糖基化Ig Y产物的免疫活性进行了研究。ELISA结果表明,葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、果糖Ig Y糖基化产物的免疫活性在反应到第6天达到最高,分别比天然Ig Y提分别提高了30.3%、13.7%、12%、22.4%。分子量5000的Ig Y葡聚糖糖基化产物在反应到达第24天达到最高,但比天然Ig Y降低14.3%,分子量20000、40000、70000的Ig Y葡聚糖糖基化产物在反应到达第6天最高,分别降低37.4%、40.4%、44.3%。同时发现,葡聚糖糖链长度越短,免疫活性越高,其中G5000K>G20000K>G40000K>G70000。5.对单糖与聚糖糖基化Ig Y产物在模拟胃肠液中的稳定性进行了研究。ELISA结果表明,天然Ig Y经过模拟胃肠液消化后活性保持率在20.1%。葡萄糖和岩藻糖糖基化Ig Y产物的免疫活性保持率均在18天达到最高,分别比天然Ig Y提高了201%和121%;甘露糖基化Ig Y产物在12天达到最高,比天然Ig Y提高了200%;果糖糖基化Ig Y产物在24天达到最高,比天然Ig Y提高了180%。同时研究发现,随糖基化反应时间增加,聚糖Ig Y糖基化产物在模拟胃肠液中的稳定性有不同程度降低。