第一部分:脊髓小脑性共济失调3型小鼠的脑电研究背景:脊髓小脑性共济失调(Spinocerebellar ataxias,SCAs)是一种在临床上和遗传上多相群的遗传性神经退行性疾病,是人类神经系统的主要遗传疾病之一,也是遗传性共济失调的主要类型。患病率约在1-5/10万,平均发病年龄为30岁,发病后生存期大多数为10余年,并且有近38%的患者直接由于该疾病导致死亡。SCAs有众多的亚型,不同亚型在各地区和种族中的发病率不一致,形成了SCAs纷繁、复杂的临床表现。SCA3又称马查多-约瑟夫病(MJD),疾病的相关基因是为ATXN3/MJD1,于1994年被克隆,编码的蛋白是Ataxin。在中国人群中,该型几乎占所有SCA患者的50%。SCA3被认为是认知功能损害最常见的亚型,对于SCA3型初期首发症状多表现为下肢共济失调,表现为走路时步履不稳、肢体摇晃、动作反应迟缓及准确性变差;中期说话时发音含糊不清、无法控制音调、眼球转动不平顺、影像容易产生“重叠”(复视)、肌肉不协调感加重、无法写字、有时感到吞咽困难、进食时容易呛咳;晚期说话极不清楚、甚至无法言语、肢体乏力、不能站立、需靠轮椅代步、理解能力逐步下降、最后失去意识、昏睡不醒。SCA疾病被人发现了以后,国内外无数研究者们对其进行了多方面的深入研究,认识到了脊髓小脑性共济失调患者存在认知功能的损害,在这以后,研究者们便开始探索更深层次的发病机制,并且尝试了很多方法,试图从不同的角度证明他们关于发病机制的猜想,目前对SCA疾病的研究多是基因及病理生理方面,通过神经内分泌方面对SCA最常见的分型SCA3小鼠学习记忆进行研究目前尚且不多,脊髓小脑型共济失调3型小鼠的脑电研究目前未见相关报道。脑-机接口((Brain-Computer Interface,BCI)是近现代科学家们开发的一套系统,其功能十分强大,它可以将人脑同其他电子设备进行连接,从而让人能够通过大脑去控制这些设备,而该设备的理论基础则是通过人脑的脑电波来实现的,该种设备很大的优点,就在于它不需要借助人体自身的外周神经和肌肉组织等,便能够将脑电波的信号输入到外部设备中去,再通过计算机和一些算法对该脑电信号进行处理,转换成可以被外部电子设备所识别的机器信号,从而使人脑能够对复杂的机械装置进行实时控制,而最初的脑电信号也是从人大脑中特定的区域采集的,该信号记录了一群特定神经元的活动。而该脑-机接口技术中,最重要的一个环节,就是对大脑特定的区域进行信号采集,并将该信号进行处理。相关学者建立了一整套的脑-机接口研究系统,该系统主要是针对于动物实验的,本实验利用脑-机接口技术首次对SCA3模型小鼠进行脑电采集并对脑电信号进行了特征分析。目的:本文研究的目的是探讨利用脑-机接口技术采集SCA3模型小鼠中枢神经系统的脑电信号,分析并识别小鼠某些特定脑区中的特征信号,通过对照试验记录各项参数,对各组进行区别,为临床诊断和疾病发病机制的研究提供新的依据。方法:雄性SCA3基因小鼠和雄性野生型(WT)小鼠均来源于郑州大学实验动物中心,体重20-23g,年龄12个月老年期SCA3小鼠和WT小鼠各一组,每组6只,年龄3个月生长期SCA3基因小鼠一组,每组6只。自制电极,植入小鼠小脑及大脑皮层运动区,利用Blackrock cerebus128通道采集系统,进行以下数据采集与分析。1.12月龄雄性SCA3小鼠与雄性WT的小鼠进行α、β、θ、δ四种脑电波比较和lz复杂度比较。2.12月龄雄性SCA3小鼠与雄性WT的小鼠进行场电位的近似熵和C0复杂度平均值对比。3.12月龄雄性SCA3小鼠与3月龄雄性SCA3小鼠进行β波段lz复杂度对比。结果:1.12月龄SCA3造模小鼠相比于WT小鼠四个波段的能量均明显增高,四个波段能量对比数据经过t检验后发现p值分别为0.000,0.0005,0.0001,0.0013;均有统计学差异,lz复杂度在β波段最为明显。2.12月龄SCA3造模小鼠与WT小鼠场电位分析中造模组小鼠近似熵较低,C0复杂度较高。3.12月龄雄性SCA3小鼠与3月龄雄性SCA3小鼠在β波段lz复杂度对比中,3月龄SCA3小鼠lz复杂度较低,12月龄SCA3行小鼠lz复杂度较高。结论:数据表明,SCA3小鼠发病以后的脑电波在各波段均有增强,且可通过β波段lz复杂度来进行区分,场电位分析中,发病小鼠的近似熵较正常值低,C0复杂度较正常值高。3月龄SCA3小鼠发病无明显症状,各项脑电波特征与正常小鼠一致,12月龄SCA3小鼠出现明显发病特征。第二部分:SCA3小鼠差异性表达基因mRNA的生物信息学分析背景脊髓小脑性共济失调(Spinocerebellar ataxia,SCA)是一种以常染色体显性遗传的神经系统退行性疾病,该疾病具有的高度临床异质性等特点。该疾病的患病率大概在8-12/10万之间,病人一般在30-40岁间发病,该神经退行性疾病存在遗传的早现性等特点,发病后患者的生存期一般在10-20年之间不等。SCA最早在1861年被报道,当时最早是发生于一个高加索家族系当中,然后在过去的100多年之间,各种不同类型的SCA家系也在世界各地不断地被发现,越来越多的不同的SCAs类型的致病基因被定位,目前人类已经明确的被发现的基因型SCA的亚型已经有30多种。为研究方便,根据遗传方式将其分为常染色体隐性共济失调型(autosomal recessive cerebellar ataxias,ARCA),常染色体显性共济失调型(autosomal dominanl cerebetlar ataxias,ADCA),X连锁性共济失调型,对于没有遗传史的病例称为散发型。SCAs属于ADCA。自从SCA患者在认知功能上存在损害的现象被人们发现以后,研究者们对于其更深一层的发病机制的研究从来都没有停步,研究者们尝试着从各种不同的角度,再运用多种不同方法,去证实而不是寻找机制,目前对SCA疾病的研究多是基因及病理生理方面。生物信息学是一门需要通过信息学技术对生物学实验数据进行加工、存储、检索与分析,最终能够揭示所获得的海量数据背后所蕴含的生物学意义的学科。我们通过生物信息学方法去研究这些信息,就可以较为方便的在大量的生物信息中提取出我们所需要的关键的知识,进一步便可以用生物信息学的分析方法去帮助我们寻找可能具有相当研究价值的基因,并且通过用实验来研究证实该基因的表达。本研究便是应用了该种生物信息学的分析方法,利用基因芯片获取表达谱数据,对其基因富集分析以及蛋白质相互作用网络等分析,来获取脊髓小脑共济失调转基因小鼠小脑组织的基因表达变化。近年来,人们虽然在脊髓共济失调方面取得了显著的成果,但却仍旧没有完全地阐明SCA3的临床特征及发病机制。然而在SCA3患者机体中,往往同时会有很多基因表达会发生或多或少的改变,其中值得我们去深入研究的问题包括以下几种:基因之间是否具有相互作用、它们的表达产物之间又是否有相互作用或者这些同时表达同时改变的基因又是否可以作为潜在的治疗靶点。将这些关系研究透彻可以有助于我们进一步探索SCA3的发病机制,可能会带来意想不到的效果。这几年来,随着基因和蛋白质技术的不断成熟和大范围运用,大量的与SCA3相关的基因数据被研究,因而我们很有必要在海量信息中发现并分析SCA3发病机制的重点环节,并对重点基因进行分析。而在本研究中,我们通过生物信息学的方法对一组脊髓小脑性共济失调转基因小鼠小脑组织基因的表达变化进行了分析和验证。目的分析脊髓小脑性共济失调3型转基因小鼠小脑区域与正常野生型小鼠的基因表达差异,从分子角度探求其发病机制,探讨其中的生物学意义。方法通过基因芯片技术获取转基因小鼠小脑的基因表达数据集。该数据集一共有12个样本,6个为SCA3转基因小鼠,6个为野生型小鼠。然后采用NOISeq方法对基因芯片数据进行处理以及差异基因(differentiallyexpressed genes,DEGs)的筛选。对所有筛选出来的基因进行聚类分析、GO富集分析以及Pathway富集分析。再将所有差异基因上传至STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,STRING)数据库并对所有差异基因进行DEGs的蛋白质相互作用(protein-protein,interaction)网络分析。结果转基因小鼠中一共发现了36个DEGs,其中4个基因表达上调,32个基因表达下调。GO富集的生物学过程分析表明:差异基因主要涉及到了细胞的发育生长、细胞周期、单细胞和多细胞的生物过程、多个生物过程的调节及其正负反馈、对共生体在宿主的生长调节、对细菌、无机物、金属离子、外部生物刺激产生答应、分解代谢等过程;分子功能表明:差异基因主要涉及糖胺聚糖、金属离子、生长因子、阳离子、受体等的结合、催化活动以及转运活动。通过KEGG分析发现:这些差异基因主要参与唾液分泌、在癌症中的转录失调、黏着、阿米巴病、肺结核、胃酸分泌、卟啉和叶绿素代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢和非洲锥虫病等信号通路。PPI网络分析显示Ltf、Ngp、S100a8、S100a9、Mpo、Camp等蛋白与其他≥5个蛋白质之间存在相互作用关系,是此蛋白质相互作用网络的中心蛋白。结论SCA3可能通过上调Hspb1、Rps27rt、Eno1b和Nrgn等基因,下调S100a8、S100a9、Ltf、Mpo、Camp、Ngp、Elane、Chi3I3和Eif2s3y等基因,参与了SCA3的发病机制。第三部分:脊髓小脑共济失调3型差异表达基因microRNAs的生物信息学分析背景SCA是一类具有明显的临床特征和遗传异质性的疾病,也是最常见的中枢神经系统退行性疾病,其最主要表现有共济失调和辨距不良等等,该疾病呈常染色体显性遗传。在目前的研究之中,研究者们通过遗传连锁定位的方法,已经发现33种基因型,并且克隆出了19种基因,在其中SCA3/MJD是最常见的一种亚型。其致病的基因为ATXN3/MJD1,该基因定位于第14号染色体短臂(14q32.1),其3’端蛋白编码区包含了胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤(CAG)三核苷酸的重复序列,该重复序列在正常人体中的重复次数为12-44次,然而在SCA3/MJD的患者机体内却可以高达60-87次。ATXN3基因编码蛋白ataxin-3的羧基末端(c末端),包含了一段多聚谷氨酰胺(Poly Q)肽链,而其扩展突变型ataxin-3蛋白可以选择性地在中枢神经系统中的特定区域(比如小脑、脑干、脊髓等)内积聚,从而逐渐形成神经元核内包涵体(NIIs)。并且,随着Poly Q扩展突变型ataxin-3蛋白表达水平升高,脊髓小脑性共济失调3型患者的病情也会逐渐加重,就目前的研究而言,关于体内调节Poly Q扩展突变型ataxin-3蛋白表达的机制仍旧没有完全阐明。最新的研究表明,miRNA和si RNA也参与到SCA3的调控中去了,而且已经筛选出调节SCA3的相关miRNA,其中表达异常显著上调的miRNA有miR-34b和miR-32,表达显著下调者有miR-29a、miR-125b、miR-25和miR-181b。而该研究的相关数据已经提交至miRBase数据库,可以供研究者们深入挖掘。Micro RNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA,miRNA在细胞内具有多种的调节作用,其地位比较重要。每一个miRNA都可以作用于多个靶基因,反之,几个miRNA也可以调控同一个基因。而这种复杂的调节网络不仅可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达,而且同时也能够通过几个miRNA的不同组合来精细调控某一个基因的表达。据目前研究推测,miRNA调节着大约人类1/3的基因。最近的研究还表明,大约70%的哺乳动物体内的miRNA是位于TUs区的(transcriptionunits,TUs)(Rodriguez et al,2004),并且其中大部分miRNA是位于内含子区域的(Kim&Nam,2006)。而据研究表明,在不同的物种中,部分的内含子miRNA位置不仅具有高度的保守性质,而且内含子miRNA在基因序列上也呈现出高度的同源性(Pasquinelli etal,2000;Ruvkun et al,2001;Lee&Ambros,2001)。miRNA所具有的高度的保守性,与其功能的重要性密不可分。除此以外,miRNA还与其靶基因的进化有着密不可分的联系,而通过研究其进化历史,将会有助于研究者们进一步地了解其作用的机制以及相关功能。本研究借助基因芯片研究脊髓小脑性共济失调转基因小鼠小脑的差异表达microRNAs,对其进行生物信息学分析,进一步探讨其发病机制以及相关microRNAs的表达变化,并对这些差异表达的microRNAs进行GO注释、KEGG富集分析和转录调控网络的分析,阐述脊髓小脑性共济失调在分子水平的发病机制。目的分析脊髓小脑性共济失调3型转基因小鼠小脑与正常野生型小鼠小脑的microRNA表达差异,从分子角度探求其发病机制,探讨其中的生物学意义。方法提取SCA3转基因小鼠中的RNA,从中分离出microRNA,再借助芯片获取其中的miRNA表达谱,并对所有筛选出来的microRNA的预测靶基因进行聚类分析、GO富集分析以及Pathway富集分析。并对其中的6个基因进行了验证。结果实验中发现SCA3转基因小鼠中一共有117个差异表达的microRNA,其中55个microRNA显著上调,62个microRNA显著下调。其生物学分析过程表明,这些差异表达的microRNA主要涉及器官、细胞组成、细胞蛋白修饰过程、细胞生物合成、Ras蛋白信号转导、细胞生物黏附、微管运动、细胞骨架和细胞增殖。分子功能表明:这些靶基因主要涉及阳离子、金属离子等的结合、GTP酶活性的调节、核苷三磷酸酶活性的调节、腺嘌呤核苷酸的结合和腺苷酸环化酶活性。通过KEGG分析发现,这些差异表达的microRNA的靶基因主要参与胰岛素耐药及转导通路、其他类型的0-聚糖的生物合成通路、ECM受体相互作用通路、甘油磷脂代谢通路、甘油磷脂代谢、磷脂酰肌醇信号系统、甘露糖型0-聚糖的生物合成、丙酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢和补体及凝血级联反应等通路。结论研究中发现117个差异表达的microRNA,其中55个miRNA表达上调,62个miRNA表达下调,其中miR-34b、miR-25等比较重要,可能通过对mRNA进行调控,参与到了脊髓小脑性共济失调的发病机制中去,并对其中6个关键基因进行了q RT-PCR验证。