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目的:构建由癌胚抗原启动子(CEA promoter,Cp)驱动的双自杀基因CD-TK治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK,研究癌胚抗原启动子能否控制CD-TK基因在CEA阳性大肠癌细胞中专一性表达和杀伤,比较融合基因与单基因对肿瘤细胞生长抑制方面有无差异,是否存在协同效应,并确定安全有效的药物使用浓度。观察旁观者效应。方法:分别以提取的人血细胞基因组DNA,pMD18-CD质粒和tgCMV/Hy-TK质粒为模板,PCR扩增Cp、CD和TK基因片段,采用双酶切、连接等方法依次将Cp、CD、TK基因亚克隆到载体pcDNA3.1(-),构建含Cp启动子和CD-TK融合基因的载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK。将靶向性载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK通过脂质体介导的方法分别转染CEA阳性的人大肠癌SW480细胞和CEA阴性的Hela细胞,采用RT-PCR检测在CEA启动子的调控下CD-TK融合基因分别在CEA阳性的人大肠癌SW480细胞和CEA阴性的Hela细胞的表达情况。并通过MTT法测定给予药物作用后双自杀基因对SW480细胞和Hela细胞的杀伤效应,以观察由CEA启动子驱动的CD-TK基因在CEA阳性细胞和阴性细胞中的细胞毒作用。单独或联合给药GCV和/或5-Fc,在不同浓度的药物作用后,MTT法测定双自杀基因对SW480细胞的体外杀伤效应,比较融合基因与单基因对肿瘤细胞生长抑制方面有无差异,是否存在协同效应,并确定安全有效的药物使用浓度。以不同比例混合转染与未转染细胞,加药处理,用MTT法检测药物对SW480细胞的抑制率,以观察旁观者效应。结果:1.519bp的Cp基因片段、1310bp的CD基因片段、1129bp的TK基因均克隆正确。2.靶向性基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK经凝胶电泳和DNA测序证实构建正确。3.转染了靶向性载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK的SW480细胞经过RT-PCR鉴定证实有CD-TK基因的表达,CEA阴性Hela细胞则没有CD-TK基因的表达。4.在细胞培养试验中,转染了靶向性载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK的SW480细胞对前药5-Fc和GCV敏感。单独用前体药物处理转染载体的细胞SW480,在GCV,5-Fc浓度分别为1μg/mL,160μg/mL时,对SW480细胞的生长抑制率分别为32.33%和31.54%(P＜0.01)。二者联合使用对SW480细胞的生长抑制效果更为显著,生长抑制率达60.70%(P＜0.01)。5.用前体药物处理部分转染的SW480细胞可见旁观者效应,当转染与未转染的SW480细胞的混合比例为50%时,即表现出显著的旁观者效应。而联合用药的旁观者效应较单独用药则更为明显(39.28%,P＜0.01)。结论:正确构建了靶向性基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK。CEA启动子能控制CD-TK基因在CEA阳性大肠癌细胞中专一性表达和杀伤。联合应用CD/5-Fc和HSV-TK/GCV系统的肿瘤杀伤效应比单独应用CD/5-Fc或HSV-TK/GCV强。同时显示较强的旁观者效应。