【摘 要】
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新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的新城疫（Newcastle disease,ND）,作为禽类烈性传染病具有较高的发病和死亡率,在我国广为流行。随着疫苗的大规模使用,近年来,典型新城疫已不多见。由于常用的疫苗株与我国当前主要流行的基因Ⅶ型毒株存在较大的抗原性差异,所以即使大规模接种疫苗,仍然会有新城疫暴发的可能。此外,现有的ND疫苗大部分是由全病毒制备而成的
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新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的新城疫（Newcastle disease,ND）,作为禽类烈性传染病具有较高的发病和死亡率,在我国广为流行。随着疫苗的大规模使用,近年来,典型新城疫已不多见。由于常用的疫苗株与我国当前主要流行的基因Ⅶ型毒株存在较大的抗原性差异,所以即使大规模接种疫苗,仍然会有新城疫暴发的可能。此外,现有的ND疫苗大部分是由全病毒制备而成的,其大量免疫造成了临床上无法区分疫苗免疫和野毒感染,给ND的监测、防控及净化带来极大的困扰。因此,亟需研发一种可实现区分疫苗免疫和野毒感染的基因Ⅶ型NDV标记疫苗。本项目利用反向遗传操作技术,以禽偏禽腮腺炎病毒II型（Avian metaavulavirus 2,AMAV-2）为骨架,将基因Ⅶ型NDV F和HN蛋白的胞外区分别替换至禽偏禽腮腺炎病毒II型的相应区域,构建并获得了基因Ⅶ型NDV标记疫苗株,可通过NDV NP ELISA检测技术实现对疫苗免疫和野毒感染的鉴别诊断。具体研究内容和结果如下:1、AMAV-2 Y2株载体的构建及其NP抗体交叉反应评价对NCBI中已经公布的12条AMAV-2全基因组序列进行序列分析比对,选定相对保守的F8株为参考株,突变F8株中10处氨基酸密码子为其余毒株共有的一致序列,增加一段大部分毒株共有的非编码区序列,得到一株新的AMAV-2毒株的全基因组序列,命名为Y2株（14906 bp）。通过人工合成和克隆的方法,构建并获得了Y2株的全长c DNA克隆质粒,拯救并获得了重组病毒。对其毒力指标进行测定,结果显示,Y2株的鸡胚最低致死剂量的平均致死时间（MDT）大于168 h,1日龄雏鸡的脑内致病指数（ICPI）为0.9,判定为弱毒株,鸡胚尿囊液的病毒含量为108.83EID50/m L,HA效价为9 log2,在BHK-21细胞中的增殖滴度为105.49TCID50/m L,生长曲线测定结果显示,Y2株在60 h时达到平台期,最高滴度为103.24TCID50/m L。将Y2株接种SPF鸡,测定其抗体产生情况。以Y2株为抗原,检测免疫鸡血清的AMAV-2 HI抗体,接种3周后AMAV-2 HI抗体水平为4–7 log2;以NDV La Sota株为抗原,NDV HI检测结果为阴性;以NDV NP ELISA方法检测结果也为阴性。Y2株可有效刺激鸡体产生针对AMAV-2的抗体,NDV NP蛋白不与AMAV-2的抗体发生交叉反应。表明AMAV-2株可以作为NDV标记疫苗的载体。2、新城疫病毒基因Ⅶ型标记疫苗株的构建及其特性应用软件预测出基因Ⅶ型NDV HB0901株和AMAV-2 Y2株F和HN基因的胞外区,采用反向遗传操作技术,将HB0901株的F和HN基因的胞外区替换至AMAV-2Y2株的相应区域,拯救并获得嵌合病毒Y2-FHNQ。随后将Y2-FHNQ株中的HB0901强毒株F蛋白裂解位点突变为La Sota弱毒株的F蛋白裂解位点,拯救并获得嵌合病毒Y2-FHNR。致病性测定结果表明,嵌合病毒Y2-FHNR株的MDT大于120 h,ICPI为0.19,符合弱毒标准,鸡胚增殖滴度为109.17EID50/m L,HA效价为9 log2,在BHK-21细胞中的增殖滴度为104.49TCID50/m L。与亲本Y2株相比,其鸡胚增殖滴度略微增加,HA效价相近。稳定性实验结果表明,嵌合病毒Y2-FHNR能够稳定鸡胚传代至少10代。本研究获得了基因Ⅶ型新城疫病毒标记疫苗株Y2-FHNR株,后续将开展Y2-FHNR株灭活疫苗的动物实验,以评价其免疫原性。
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