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犬流感病毒是危害犬类的一类重要病毒,本论文利用流感病毒反向遗传操作技术,拯救了一系列H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Zhejiang/01/2010(H3N2)(简称ZJCIV)和PR8(A/Puerto Rico/8/34(H1N1))的重组病毒,筛选获得了一株高效表达H3N2亚型犬流感病毒表面抗原的重组病毒；利用PR8病毒微型复制子系统,研究了包装效率最高的情况下,流感病毒8个基因片段末端序列对报告基因(Firefly luciferase)转录的影响,同时比较研究了不同包装效率下,M基因末端序列对报告基因转录的影响。近年来爆发的H3N2亚型犬流感对我国不同种类的犬构成极大威胁,目前还没有有效的疫苗用于该病毒防制。ZJCIV在鸡胚和MDCK细胞上的增殖能力均很差,为了获得高效表达ZJCIV病毒表面抗原的重组病毒,本实验利用反向遗传操作技术,将ZJCIV的HA和NA基因与PR8病毒的内部基因及突变的NP (G132A)基因和NS2(E67/74S)进行人工重组,拯救并获得了4株犬流感重组病毒CIV-PR8、CIV-NP、 CIV-NS和CIV-NP-NS。用含100EID50的病毒接种9-11日龄SPF鸡胚。CIV-NS,CIV-NP-NS接种鸡胚36h后,尿囊液的HA滴度达到最高,CIV-NP和CIV-PR8在接种48h后尿囊液的HA滴度达到最高,CIV-NS的血凝效价平均值可达213.33。用2×103TCID50的病毒感染MDCK细胞,CIV-NS的细胞上清HA滴度最高,可达210,CIV-NP-NS次之为29,而野生病毒ZJCIV只有24；无论通过鸡胚扩增还是细胞扩增,4株重组犬流感病毒的TCID50均高于ZJCIV,其中CIV-NS的TCID50高于其他毒株。本研究我们成功救获了4株增殖能力明显高于野生毒株ZJCIV重组犬流感病毒,CIV-NS在鸡胚和MDCK细胞上的增殖能力明显优于其他毒株,该重组病毒有望成为犬流感疫苗研制的候选种毒。流感病毒基因片段的3’端和5’端非编码区及部分编码区序列不仅起包装信号的作用,而且这些序列决定了流感病毒各基因的表达量。本研究将PR8流感病毒株最高包装效率的8个基因片段5’和3’末端序列分别克隆于RNA聚合酶Ⅰ启动子和RNA聚合酶Ⅰ终止子之间,并且在5’和3’端之间设计酶切位点,然后在酶切位点之间插入报告基因(Firefly luciferase),并将5’端编码区的起始密码子ATG突变为GTG,改造后的基因只转录表达报基因的开放阅读框。将构建的质粒分别与表达流感病毒PB1、PB2、PA、NP及表达内参Renilla luciferase的5个表达质粒共转染293T细胞,利用双荧光素酶报告基因系统比较在包装效率最高的情况下,流感病毒8个基因片段末端序列对报告基因(Firefly luciferase)转录的影响。研究发现,PA基因末端的转录水平最高,而M基因末端的最低。选择了M基因片段的5种包装效率下的末端序列,用同样的方法构建重组质粒,将构建的质粒分别与表达流感病毒PB1、PB2、PA、NP及表达内参Renilla luciferase的5个表达质粒共转染293T细胞,利用双荧光素酶报告基因系统比较在包装效率不同的情况下,流感病毒M基因片段末端序列对报告基因(Firefly luciferase)转录的影响。结果发现vRNA (?)勺5’端为220个核苷酸和3’端0个核苷酸的转录水平最高。以上研究为构建高效表达流感病毒基因和外源基因的流感病毒载体奠定了基础。