论文部分内容阅读
纤维素作为世界上最丰富的有机物质,然而其资源并没有得到充分的开发利用,甚至有很大一部分纤维素变成环境污染物。关于有纤维素分解能力的微生物研究报道很多,这些微生物大部分是从植物残体及土壤中分离的。从动物肠道内分离纤维素分解菌的研究很多,但多是从反刍动物瘤胃中分离得到的。目前,关于鹅盲肠分解纤维素的细菌的研究很少。作为草食动物的鹅,其对纤维素类物质有很强的消化能力。因鹅的盲肠中栖息着很多微生物,所以部分学者认为鹅盲肠和反刍动物瘤胃一样具有发酵功能。为了充分利用纤维素,本实验对鹅盲肠纤维素分解菌进行了分离鉴定,并优化其发酵产酶的条件,研究酶的性质,为该菌的应用及研究奠定一定的基础。本试验随机选6只扬州白鹅,公母各一半。饥饿处理24 h,处死,取其盲肠,从其内容物中分离出一株有纤维素分解能力的细菌,通过DNS法测定其发酵培养上清液酶活力值为1.25 U*mL-1。通过形态学和16SrDNA鉴定,并做系统进化树,发现该菌株与解淀粉芽孢杆菌亲缘关系最近,命名为Bacillus amyloliquefaciens S1。通过单因素和正交试验,对B.amyloliquefaciens S1产纤维素酶条件进行优化,得到其最适发酵条件:发酵温度为37℃、发酵时间为72 h、发酵培养基起始pH为6.0、装液量为75 m L/250 mL;各因素对B.amyloliquefaciens S1产酶能力影响的大小顺序依次为:pH值>培养时间=培养温度>装液量。研究B.amyloliquefaciens S1纤维素酶的酶学性质,结果显示,该菌所产纤维素酶的最适催化反应温度为60℃,pH为7,该酶耐热,耐酸碱,对纤维素类物质的分解作用较广泛。Fe3+对该纤维素酶活力有一定的抑制作用,而K+、Cu2+、Fe2+、Mn2+和Zn2+对酶活力都有显著的促进作用。试验克隆得到B.amyloliquefaciens S1的一种纤维素酶基因,该基因ORF片段大小为1500 bp,编码499个氨基酸,该序列在Genbank与已有序列进行BLAST比对分析,发现与其它解淀粉芽孢杆菌的纤维素酶基因有97%-99%的同源性,用MEGA5.1软件对其进行进化树分析,鉴定本试验克隆得到的基因序列为解淀粉芽孢杆菌纤维素酶基因序列。把B.amyloliquefaciens S1纤维素酶基因插入到pET-28(a+)载体,并成功在大肠杆菌中诱导表达,产物经SDS-PAGE凝胶电泳分析和Western blotting检测,分子量约为55 kD。