前列腺癌是西方国家男性最常见的癌症,也是欧洲和美国男性恶性疾病死亡的第二大主要原因[1]。近年来在亚洲国家,前列腺癌的发病率也呈快速增长的趋势。去势治疗一直是最常使用的治疗前列腺癌的方法,大多数转移的病人接受治疗后的初期,表现为癌症的消退。然而,在大多数病人中,此种癌症最终会复发并进展为雄激素非依赖的状态,此时,去势治疗方法不再有效。因此,发展其它的治疗策略,对于提高雄激素非依赖前列腺癌病人的生存率势在必行[2]。目前,肿瘤治疗的方向主要集中于细胞凋亡(调高促凋亡基因或调低抗凋亡基因的表达)、肿瘤的靶向治疗、多肽类细胞因子等,而细胞凋亡是目前肿瘤治疗的热点之一。以VEGF和FGF2为靶点,抑制肿瘤血管生成的治疗策略也已成为研究的热点。本研究组已成功的设计和表达了一种新的抗前列腺癌的多肽药物APP216,并经体内外实验验证了其活性,为前列腺癌的特异治疗提供了新的制剂和方法。其根据PSA具有的肿瘤定位特异性及丝氨酸蛋白酶活性,基于BH3、VEGF拮抗肽K237、FGF2拮抗肽DG2结构域的一级结构,辅以最易被PSA特异性裂解的多肽的氨基酸序列,设计了可被PSA特异性水解的多肽APP216。然而,本课题需要通过实验研究确认各功能结构域的杀伤肿瘤作用,以便对此多肽进行优化,从而为前列腺癌的治疗提供高效、特异的制剂,也为前列腺癌的治疗探索新的策略和方法。本实验共分三部分内容:第一部分:血管生成因子(VEGF和FGF2)及其受体(KDR和FGFR2在前列腺癌细胞系中的表达目的:探讨人前列腺癌细胞株血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体(KDR),碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)及其受体(FGFR2)的表达,进一步阐明前列腺癌细胞中VEGF和FGF2的自分泌机制。方法:选取三种前列腺癌细胞株(PC3、LNCap和DU145),采用免疫细胞化学染色、RT-PCR及Western blot,检测VEGF及其受体KDR,FGF2及其受体FGFR2的表达。结果:三种前列腺癌细胞株(PC3、LNCap和DU145)中均有VEGF、KDR及FGF2、FGFR2的表达,但表达水平略有差别。结论:在前列腺癌的血管形成中可能存在VEGF和FGF2的自分泌机制。第二部分:抗前列腺癌多肽APP216各功能结构域对前列腺癌细胞系LNCap的影响目的:探讨人工合成的三段肽(K237、DG2、BH3)对前列腺癌细胞系LNCap增殖的影响。方法:以激光共聚焦显微镜观察肽的细胞定位;观察经BH3处理后,LNCap细胞凋亡过程中核染色质的形态学变化和LNCap细胞的凋亡改变;用流式细胞仪分析不同时间不同浓度的BH3肽对细胞凋亡程度的影响和不同浓度的短肽对细胞周期的影响;经MTS/PMS测定,分析短肽对LNCap细胞的增殖是否有时间和浓度依赖性的影响。结果:激光共聚焦结果显示BH3肽主要定位在细胞核内,K237肽和DG2肽定位在胞核和胞浆;LNCap细胞经肽BH3处理后,可观察到分为二期的细胞凋亡过程,Hoechest凋亡染色证实:BH3以浓度依赖性促进了LNCap细胞的凋亡;流式细胞仪检测结果证实了短肽对细胞凋亡程度和周期的影响;MTS/PMS测定表明除肽DG2外,其它短肽具有浓度和时间依赖性的抗前列腺癌细胞的活性。结论:BH3肽可有效地诱导前列腺癌细胞系LNCap的凋亡;肽K237在体外能抑制前列腺癌LNCap细胞的恶性增殖,并呈时效和量效关系,其机制可能与短肽K237通过抑制自分泌途径抑制了前列腺癌细胞的增殖有关,并干预了细胞周期的调控,从而影响其增殖;肽DG2可以将LNCap细胞阻滞在G1/G0期,理论上来讲是抑制了自分泌环的结果,但MTS/PMS测定未见其抑制前列腺癌细胞的活性。实验结果初步的证实了短肽杀伤LNCap细胞的作用,为下一步的体内实验奠定了基础。第三部分:抗前列腺癌多肽APP216各功能结构域对人前列腺癌LNCap裸鼠种植瘤影响的研究目的:观察多肽BH3、DG2和K237在体内对前列腺癌的影响。方法:人前列腺癌细胞株LNCap细胞接种于40只裸鼠,建立人前列腺癌裸鼠移植瘤模型,并将其随机分成四组,分别为对照组、BH3组、DG2组及K237组,观察各组治疗后的移植瘤重量及体积,并计算抑瘤率;免疫组化检测移植瘤CD34的表达;HE染色观察各多肽对荷瘤裸鼠重要脏器的毒性作用和对荷瘤裸鼠移植瘤的毒性作用;Hoechest染色检测各组肿瘤细胞的凋亡情况。结果:动物实验表明各多肽均可抑制裸鼠前列腺癌移植瘤的生长;免疫组织化学染色结果显示:CD34在K237和DG2处理组中呈弱阳性表达,而在BH3和对照组中则呈阳性或强阳性表达;对心脏、肝脏、脾脏、肺脏及肾脏的病理组织切片观察,未发现各组织有病理损伤,而对肿瘤组织产生了毒性作用;凋亡结果显示:凋亡程度BH3组﹥K237组﹥DG2组﹥对照组。结论:成功的利用多肽BH3、DG2和K237抑制了前列腺癌移植瘤的生长(K237的治疗效果优于DG2,DG2优于BH3),验证了各段短肽的杀伤肿瘤的作用,为肿瘤的靶向治疗奠定了基础。