杆状病毒是一种重要的生物杀虫剂和基因工程的表达系统,在基因治疗中也能发挥重要的作用。目前对杆状病毒基因组和重要基因的分子生物学已经有了一定的认识,但是病毒基因组中大部分基因仍然有待深入研究。Tn5介导的杆状病毒AcMNPV突变库的建立对于推进病毒功能基因组学的研究具有重要意义。　　 本文以从突变库中筛选出的一株病毒复制缺陷突变株Apra165,以该突变株为研究对象,应用AcMNPV全基因组上的88条引物分别与转座子上的引物配对组合,经过五轮PCR和两次测序,精确地确定该突变体中Tn5转座子逆向插入ORF66起始密码子ATG下游85bp处。　　 为了排除突变株Apra165可能带有的其他突变对病毒复制的影响,本文通过同源重组的方法构建了携带egfp报告基因的orf66缺陷型定向重组Bacmid DB165,证实orf66基因处转座子的插入确实导致了病毒无法复制和表达报告基因。进一步通过系列的共转染实验初步说明转座子插入破坏了病毒DNA聚合酶基因(DNA-pol)的启动子区域,影响了其正常表达,从而导致复制缺陷,而orf66基因可能是AcMNPV非必需基因。　　 AcMNPV ORF66有三个比较显著的保守结构域,分别是Desmo_N,CorA和Smc,其中CorA可能与RNA剪接相关。通过RT-PCR检测orf66基因在sf9细胞内的转录时相,表明orf66是一晚期基因。其具体功能还有待进一步研究。　　 本研究对一株复制缺陷突变体,用基于AcMNPV全基因组PCR方法确定转座子插入位点,并在定向重组的Bacmid基础上对突变体复制缺陷机制和orf66基因的表达和功能进行了初步的研究。本实验设计和思路可被广泛应用于突变体库中其他突变体的研究,从而大大有利于杆状病毒AcMNPV大量未知功能的开放阅读框的解读。此外,orf66的基因功能还有待进一步研究证实。