癌症干细胞是癌细胞中存在的一类具有干细胞特性的亚细胞群体,其具有能够抵御抗肿瘤化学疗法和放射性疗法的能力,并能够通过自我更新和分化作用形成肿瘤中其他所有类型细胞。因此科研工作者迫切的需要分离出高纯度的癌症干细胞对其进行研究来攻克癌症这一难题。然而,由于癌症干细胞缺乏统一的标志物,通过目前存在的癌症干细胞的识别与分离方法很难大批量的拿到高纯度的癌症干细胞。结肠癌干细胞在结肠肿瘤的生长、转移以及抗药和抗辐射疗法的过程中均起着至关重要的作用。因此,急需建立一种新型的能够准确识别与分离该类细胞的方法来实现对这类细胞的深入研究。本文从癌症干细胞拥有较慢的分裂和代谢速度这一特有的生物学特性出发,建立了一种具有普适性且快速高效的癌症干细胞分选方法。本论文工作通过以下三部分,循序渐进的展开。首先选取结肠癌细胞系HCT-116开展了细胞同步化条件探索,以减少细胞不同步对实验可能造成的影响。癌症干细胞会暂时脱离细胞周期,停止细胞分裂,因此与正常癌症细胞相比,其拥有较长的GO期。由于处于不同细胞周期的细胞DNA含量不同,其细胞分裂及代谢速度也有一定的差别,因此将所有细胞同步至同一细胞周期后进行实验有可能消除以上因素对实验带来的影响。在利用癌症干细胞分裂速度这一生物学特性对其进行识别与分选的过程中,将细胞提前同步化至G0/G1期,不仅可以消除不同细胞周期分裂速度的影响,同时可以模拟癌症干细胞的生物学特性形成对照实验。之后利用荧光染料长期追踪细胞分离,观察癌症干细胞与非癌症干细胞分裂速度的差别。最后利用叠氮糖代谢标记,根据代谢时间不同最终选择性的标记代谢速度较慢的癌症干细胞,并与磁性微球相结合,从而实现了对结肠癌干细胞进行准确识别与分选。一、HCT-116细胞同步化分析通过血清饥饿法,将HCT-116细胞全部同步化至细胞周期中的G0/G1期。通过无血清培养的细胞培养方法,一定时间后经碘化丙啶(PI)标记法进行流式细胞仪检测,将所有细胞全部同步化至G0/G1期。二、基于癌症干细胞分裂速度差别的特异性识别开展了基于细胞膜染色对结肠癌细胞系HCT-116细胞中的癌症干细胞进行特异性识别的新方法研究。通过结肠癌干细胞比正常结肠干细胞具有较慢的分裂速度这一生物学特性,通过细胞膜染料对其进行标记,经过多次传代后,分裂较慢的癌症干细胞仍旧保留较多的荧光染料,因此具有比较高的荧光。通过荧光显微镜和流式细胞仪可将癌症干细胞识别出来。所识别出的细胞与结肠癌干细胞特异性标志物所标记的细胞具有高度的统一性。不同于传统的癌症干细胞识别方法,该方法是基于癌症干细胞自身的生物学特性进行识别,其更具可靠性与普适性,可用于各类癌症干细胞的特异性识别。三、基于糖代谢标记和磁性微球的癌症干细胞分选方法研究利用癌症干细胞所特有的具有较慢的代谢速率这一生物学特性,通过叠氮糖的代谢标记对其进行识别,之后结合商品化的磁珠实现分选。这与传统的通过癌症干细胞的特异性表面标志物对其进行识别与分选的方法具有本质的区别。所分选出的细胞与剩余细胞相比具有较高的肿瘤球形成效率、软琼脂克隆形成效率和结肠干细胞特异性标志物Lgr5基因的mRNA水平。该方法提供了一种新型的、具有普适性的癌症干细胞的识别与分离方法,其对于癌症干细胞的基础研究和临床检验均具有巨大的潜在应用价值。