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目的:对大面积骨缺损进行修复一直是临床上难以解决的问题。自体骨移植虽然常用,但供区损伤较大。骨组织工程概念于1995年提出,即应用工程学技术,首先制备具有良好性能的支架材料,然后将细胞负载到支架上,最后将负载细胞的支架材料种植到骨缺损部位,对骨缺损进行修复。近年来,很多研究着眼于骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的成骨分化机制,但BMSCs在骨髓中含量甚微,若进行体外扩增则需较长时间,而异基因BMSCs虽然来源及数量不受限制,但植入体内后存在免疫排斥反应,因此,BMSCs在应用于骨组织工程时难以满足临床治疗上的需要。人脂肪来源干细胞（human adipose-derived stem cells,h ADSCs）存在于脂肪组织中,具有维持自我更新、分化为多种细胞（包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等）的潜能。静止期h ADSCs占体内具有干细胞特性的细胞总数的70%。h ADSCs成骨分化过程受到遗传和表观遗传机制调控,但其具体分子机制仍不十分明确。大量的研究表明,微小RNA（micro RNA,miRNA）在h ADSCs成骨分化过程中起到了关键作用。据目前的研究报道,至少有27种miRNAs参与了h ADSCs的成骨分化过程。miR-146a和miR-26a可以通过抑制Smad1和Smad4蛋白的表达,抑制BMP信号通路,进而抑制h ADSCs成骨分化。miR-23a可以靶向RUNX2,miR-31可以靶向Osterix,进而负向调控h ADSCs成骨分化。已有研究报道miR-204-5p可以促进h ADSCs成脂分化,抑制BMSCs成骨分化,且Target Scan网站预测GDF7可能是miR-204-5p的靶基因,JASPAR网站显示转录因子FOXC1能够与miR-204-5p和GDF7的启动子结合。因此,本研究拟探究FOXC1/miR-204-5p/GDF7调控轴在h ADSCs成骨分化过程中的作用机制,为临床骨缺损的修复提供理论依据。研究方法:1、提取脂肪组织中的h ADSCs,并验证其成脂、成骨、成软骨的多向分化潜能,流式细胞检测其表面标志物CD44、CD45、CD90、CD105和HLA-DR的表达情况;2、将h ADSCs进行成骨诱导培养,q PCR检测成骨诱导0、3、5、7、10、14d miR-204-5p及成骨标志物RUNX2、ALP、OCN在细胞中的表达水平;3、在h ADSCs中转染miR-204-5p mimics或inhibitor,并分别进行普通培养基或成骨诱导培养基培养,培养14d后,q PCR检测miR-204-5p、RUNX2、ALP、OCN的表达水平,ALP、茜素红染色检测细胞成骨分化能力,Western blot检测细胞RUNX2、ALP、OCN、FOXC1、GDF7的表达水平,免疫荧光染色检测细胞OCN的表达情况;4、为验证miR-204-5p与GDF7的靶向作用关系,进行互补试验,实验分组如下:（1）OM+mimics+vector,（2）OM+mimics+GDF7,（3）OM+inhibitor+NC,（4）OM+inhibitor+si-GDF7。各组细胞培养14d后,q PCR检测miR-204-5p、GDF7、RUNX2、ALP、OCN的表达水平,ALP、茜素红染色检测细胞成骨分化能力,Western blot检测GDF7、RUNX2、ALP、OCN、p-AKT、AKT、p-P38、P38的蛋白表达水平。通过Target Scan网站预测miR-204-5p与GDF7的结合位点后,构建双荧光素酶报告基因载体,进行双荧光素酶活性检测;5、为验证FOXC1在miR-204-5p调控h ADSCs成骨分化过程中的作用,实验分组如下:（1）OM+mimics+vector,（2）OM+mimics+FOXC1,（3）OM+inhibitor+NC,（4）OM+inhibitor+si-FOXC1。各组细胞培养14d后,q PCR检测miR-204-5p、FOXC1、GDF7、RUNX2、ALP、OCN的表达水平,ALP、茜素红染色检测细胞成骨分化能力及钙离子沉积水平,Western blot检测FOXC1、GDF7及成骨相关蛋白的表达水平。双荧光素酶活性实验验证转录因子FOXC1对miR-204-5p、GDF7基因启动子的作用;6、ChIP实验检测FOXC1与miR-204-5p、GDF7基因启动子区域的作用关系以及组蛋白去乙酰化酶HDAC2、组蛋白乙酰化酶H3K9AC与miR-204-5p基因启动子的作用关系。结果:1、提取的h ADSCs具有多向分化能力,流式细胞检测结果提示CD45、HLADR几乎不表达,CD44、CD90、CD105表达阳性;2、miR-204-5p在h ADSCs成骨分化过程中表达水平降低,过表达miR-204-5p降低RUNX2、ALP、OCN的表达水平,而沉默miR-204-5p可提高其表达水平。茜素红染色和ALP染色结果均提示过表达miR-204-5p抑制h ADSCs成骨分化,沉默miR-204-5p使h ADSCs成骨分化能力增强;3、h ADSCs成骨分化过程中GDF7表达水平升高,miR-204-5p mimics降低GDF7的表达水平,过表达GDF7可以抑制miR-204-5p的表达水平,提高RUNX2、ALP、OCN的表达水平,而沉默GDF7的结果相反。茜素红、ALP染色显示过表达GDF7可降低miR-204-5p对h ADSCs成骨分化的抑制作用。同时,在miR-204-5p mimics处理下,过表达GDF7可以促进AKT和P38的磷酸化。双荧光素酶报告基因结果表明GDF7是miR-204-5p的靶点;4、过表达FOXC1可以抑制miR-204-5p的表达水平,促进GDF7、RUNX2、ALP、OCN的表达水平,沉默FOXC1的结果相反,茜素红、ALP染色结果提示过表达FOXC1可降低miR-204-5p对h ADSCs成骨分化的抑制作用;5、双荧光素酶报告基因结果表明FOXC1与miR-204-5p、GDF7的启动子结合,调控miR-204-5p、GDF7的启动子活性。Ch IP实验结果进一步证实,FOXC1通过直接结合调节GDF7和miR-204-5p的转录。同时,Ch IP实验结果也表明,FOXC1通过影响组蛋白去乙酰化酶2和组蛋白3第9位赖氨酸乙酰化酶与miR-204-5p启动子的作用阻遏miR-204-5p的转录。结论:1、miR-204-5p的表达水平在h ADSCs成骨分化过程中逐渐降低,沉默miR-204-5p促进h ADSCs成骨分化,其过表达抑制成骨分化;2、miR-204-5p靶向结合GDF7,抑制h ADSCs成骨分化,GDF7通过促进AKT和P38的磷酸化减弱miR-204-5p对h ADSCs成骨分化的抑制作用;3、FOXC1通过与miR-204-5p、GDF7的启动子结合,促进miR-204-5p启动子的去乙酰化及GDF7的转录,减弱miR-204-5p对h ADSCs成骨分化的抑制作用。