论文部分内容阅读
第一部分扩增重组腺病毒GFP、Wnt3a、BMP9并分别转染C3H10T1/2细胞目的：扩增能高度表达GFP、Wnt3a、BMP9蛋白的重组腺病毒,并检测分别转染C3H10T1/2细胞后的稳定性。方法：复苏HEK293细胞并培养,待其增殖生长至约培养瓶底面积的70%～80%,进行反复传代两次后,向细胞中分别加入适量的AdEasyGFP、AdEasyWnt3a、AdEasyBMP9原液,摇晃均匀后培养48-72h观察细胞形态发生了明显的改变后,即可收集细胞悬液。于倒置相差显微镜下观察复苏培养的C3H10T1/2细胞,待其生长铺满至约培养瓶底面积的70%时,加入适量已成功收集的腺病毒液,48h后利用荧光显微镜和流式细胞术分别观察腺病毒转染后的细胞生长变化及转染效率。结果：1、AdEasyGFP、AdEasyWnt3a、AdEasyBMP9在HEK293细胞中反复扩增后,细胞形态发生明显改变,即收集到了能够高度表达GFP、Wnt3a、BMP9蛋白的腺病毒液。2、镜下观察经BMP9、Wnt3a及二者联合转染C3H10T1/2细胞1周后,可见BMP9组、Wnt3a联合BMP9组细胞呈现纤维样生长排列,方向渐趋于一致,连接紧密；Wnt3a组细胞呈长梭形生长,排列则较为紊乱。3、利用流式细胞术得到经GFP、Wnt3a、BMP9及二者联合转染C3H10T1/2细胞48h后的转染效率均约为60%。结论：AdEasyGFP、AdEasyWnt3a、AdEasyBMP9原液在HEK293细胞中反复扩增后可以收集到高度表达的腺病毒液；分别转染C3H10T1/2细胞后各组细胞生长形态良好,并可获得较高和较稳定的转染效率。第二部分Wnt3a单独及联合BMP9诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化的作用目的：研究经Wnt3a单独以及Wnt3a联合BMP9转染C3H10T1/2细胞后其向心肌细胞样细胞分化的初步作用。方法：将C3H10T1/2细胞随机分为5组：①空白组；②GFP组；③Wnt3a组；④BMP9组；⑤Wnt3a联合BMP9组。AdEasyGFP、 AdEasyWnt3a、AdEasyBMP9分别转染C3H10T1/2细胞3周后,利用Western blot和免疫荧光技术检测各组细胞中缝隙连接蛋白43(Cx43)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达差异；实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测各组细胞中GATA结合蛋白4 (GATA4)、心肌细胞增强因子2C(MEF2C)的表达变化。结果：C3H10T1/2细胞经腺病毒转染3周后仍可稳定表达绿色荧光蛋白。Western blot和qRT-PCR结果显示Wnt3a组细胞心肌特异性蛋白Cx43、cTnT,基因GATA4、MEF2C的表达量与空白组比较无明显差异；Wnt3a联合BMP9组细胞中Cx43、cTnT、GATA4、MEF2C的表达量显著高于空白组、GFP组和Wnt3a组,而与单独BMP9组相比无显著性差异。结论：Wnt3a单独诱导C3H10T1/2细胞不能向心肌细胞样细胞分化：Wnt3a联合BMP9可诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化。